一种基于宏基因组纳米孔测序的尿路感染病原体试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体的说，涉及一种基于宏基因组纳米孔测序的尿路感染病原体试剂盒及其应用。

背景技术

尿路感染(UTI)在全世界范围内都有高死亡率和多重耐药性，所以快速精准的抗生素治疗对抑制病情发展和耐药菌株产生就显得尤为重要。临床上对于病原菌的诊断金标准依然是分离培养法，耗时长，敏感性差，无法快速指导用药。随着分子诊断技术的发展，测序技术逐渐应用于临床诊断。纳米孔测序(Nanopore sequencing)是一种新型的三代测序技术，它具有以往测序技术达不到的超长读长和实时分析的优势，在临床病原学诊断方面具有巨大潜力。目前临床上尚没有一套针对于尿路感染所有相关病原体诊断的方法存在。

发明内容

本发明的目的在于，针对目前临床上尚没有一套针对于尿路感染所有相关病原体诊断的产品的问题，提供一种基于宏基因组纳米孔测序的尿路感染病原体诊断方法及试剂盒。

本发明提供一种用于检测尿路感染病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括多聚酶(MetaPolyzyme)、裂解液(lytic enzyme solution)、病原菌核酸提取试剂盒、末端修复试剂、接头连接模块、PCR扩增试剂和磁珠。

其中，所述多聚酶为Sigma Aldrich的MAC4L-5MG；所述裂解液为Qiagen的货号为158928的裂解液；病原菌核酸提取试剂盒为Indical Bioscience的IndiSpin PathogenKit，货号为SP54104；末端修复试剂为NEBioabs的NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module,货号E7546L；接头连接模块为NEBiolabs的Blunt/TA Ligase MasterMix，货号M0367L；PCR扩增试剂为NEBiolabs的

上述试剂均独立包装，使用时按照步骤骤混合使用。

所述试剂盒以ONT的PCR条码试剂盒SQK-PBK004为基础。

本发明提供一种用于检测尿路感染病原体的试剂盒，所述试剂盒包括无差别裂解液、病原菌核酸提取试剂盒、末端修复试剂、接头连接模块、PCR扩增试剂和磁珠。

其中，所述无差别裂解液包括lytic enzyme solution和MetaPolyzyme。

其中，所述lytic enzyme solution为Qiagen的货号为158928的裂解液；所述MetaPolyzyme为Sigma Aldrich的MAC4L-5MG。

其中，所述lytic enzyme solution和MetaPolyzyme的体积比为1:2。

其中，所述病原菌核酸提取试剂盒为Indical Bioscience的IndiSpin PathogenKit，货号为SP54104；所述末端修复试剂为NEBioabs的NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module,货号E7546L；

其中，所述接头连接模块为NEBiolabs的Blunt/TA Ligase Master Mix，货号M0367L；

其中，所述PCR扩增试剂为NEBiolabs的

其中，所述磁珠为BECKMAN的Agencourt AMPure XP beads,货号A63881。

上述的试剂盒在制备用于检测尿路感染病原体产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。

所述用于检测尿路感染病原体产品为用于检测尿路感染病原体的装置、设备或者系统。

本发明开发了一种基于宏基因组纳米孔测序的尿路感染病原体诊断方法及试剂盒，可以做到在5小时以内成功检测病原体及相关耐药基因，为临床医生提供快速准确的用药指导，改善治疗效果，缩短病人住院时间，减少抗生素误用和滥用。

附图说明

图1为实施例4中的20份样本核酸浓度对比图。

图2为实施例4中的20份样本酶解法和珠打法提取核酸测序reads长度对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的尿液样本均来自北京中医药大学东方医院，大肠杆菌、屎肠球菌均购自北京中源合聚生物科技有限公司。PBS溶液购自北京索莱宝科技有限公司。

实施例1

本发明提供一种用于检测尿路感染病原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括多聚酶(MetaPolyzyme)、裂解液(lytic enzyme solution)、病原菌核酸提取试剂盒、末端修复试剂、接头连接模块、PCR扩增试剂和磁珠。

其中，所述多聚酶为Sigma Aldrich的MAC4L-5MG；病原菌核酸提取试剂盒为Indical Bioscience的IndiSpin Pathogen Kit，货号为SP54104；末端修复试剂为NEBioabs的NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module,货号E7546L；接头连接模块为NEBiolabs的Blunt/TA Ligase Master Mix，货号M0367L；PCR扩增试剂为NEBiolabs的LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix,货号M0533S；磁珠为BECKMAN的AgencourtAMPure XP beads,货号A63881。

所述无差别裂解液包括lytic enzyme solution和MetaPolyzyme。

其中，所述lytic enzyme solution为Qiagen的货号为158928的裂解液；所述MetaPolyzyme为Sigma Aldrich的MAC4L-5MG。

其中，所述lytic enzyme solution和MetaPolyzyme溶液的体积比为1:2，所述MetaPolyzyme溶液为将5mg MetaPolyzyme溶解在750μl中得到的溶液。

采用本发明用于检测尿路感染病原体的试剂盒进行检测的方法包括如下步骤：

1.样本处理与核酸提取

每种样本取1ml尿液置于1.5ml EP管中，18000×g离心5分钟对病原体进行富集，弃800μl上清至管中剩余200μl。然后，加入5μl的裂解液lytic enzyme solution(Qiagen)和10μl的多聚酶MetaPolyzyme(Sigma Aldrich，5MG，用750μl PBS中溶解)，温和翻转混匀6次。混合样品在37℃震荡孵育1h，裂解病原体细胞。使用病原菌核酸提取试剂盒IndiSpinPathogen Kit(Indical Bioscience)从裂解后的每个样本中提取DNA。同时提取无菌去离子水作为阴性对照。用100μl无核酸酶水(Takara，9012)加到QIAamp Mini膜上进行DNA洗脱得到100μl的DNA。DNA纯度和浓度用NanoDrop2000c分光光度计(Thermo FisherScientific)和Qubit 4.0荧光光度计(Thermo Fisher Scientific)结合dsDNA HS Assaykit进行分析。

2.建库及上机测序

2.1末端修复(60μl体系)

表1末端修复体系

将步骤1中得到的DNA样品，与末端修复试剂按照上表的比例混合，充分混匀，20℃反应5分钟，80℃反应5分钟。后加入1×beads进行纯化。用16μl无核酸酶的水洗脱至0.2ml的PCR管中，得到末端修复的DNA。

2.2接头连接(50μl体系)

表2接头体系

将步骤2.1中的末端修复的DNA与连接接头按照上表的比例混合，之后，用1×的beads纯化。用25μl无核酸酶的水洗脱到0.2ml的PCR管中备用，得接头连接的DNA。

2.3PCR扩增及标签连接(50μl体系)

表3扩增体系

程序

将步骤2.2中的接头连接的DNA，按照上面的PCR体系和程序，进行PCR扩增，之后重复磁珠纯化步骤，然后用10μl的Tris_HCl_NaCl(10mM Tris.HCl pH 8.0with 50mM NaCl)洗脱。取1μl进行Qubit定量，用于混样体积计算。

2.4混样和上样

将步骤2.3中纯化后的PCR产物根据浓度值，等质量混合至10μl，向10μl混样后的DNA库中加入1μl的RAP,充分混匀后置于室温孵育5min。向一管FB中加入30μl的FLT,充分震荡混匀，将混合液加载到芯片上，孵育5min。后准备上机文库，体系(75μl)如下：

表4建库体系

提前连接电脑和测序仪，芯片提前半小时取出放到室温，然后进行芯片自检，自检合格方可上机。

用R9.4.1芯片(FLO-MIN106)进行MinION测序。根据制造商的说明，总共75μl的文库DNA被加载到流动池中。MinION仪器运行约2小时。使用ONT MinKNOW GUI软件(version4.2.8)收集原始测序数据并进行实时basecalling。

3.生物信息学分析

下机数据使用guppy软件进行接头去除，使用minimap2软件进行与人类参考基因组GRCh38数据库比对以达到去除宿主序列的目的，所有剩余的非人基因组序列用samtools软件提取出来并seqkit软件进行fastq格式与fasta格式的转换。然后通过blastn软件将fasta数据映射到refseq数据库中进行比对，最后用两个本地Python脚本进行物种名称与读取序列数的统计。耐药基因用ABRicate软件调用Card数据库进行比对并输出.csv格式文件。

上述步骤中，还可以包括磁珠纯化步骤：向1.5ml的Eppendorf管中加入1×beads，用枪吹吸混匀10次，置于Hula mixer室温孵育8min，瞬时离心后置于磁力架，待澄清之后，小心弃掉上清(不要触碰到beads)。沿着管壁加入200μl新配置的80％乙醇，旋转一周(注意不要打散磁珠)，弃掉上清。重复上一步骤。弃掉上清，开盖晾干30-60s。

实施例2

本实施例以北京中医药大学东方医院的76例尿路感染(细菌性和真菌性)病人尿液样本(阳性样本45份和阴性样本31份)。以临床尿液培养结果为金标准，培养阳性样本为阳性对照，培养阴性样本为阴性对照，用来评价检测方法的灵敏度和特异性。

将阳性样本45份和阴性样本31份按照实施例1中的方法进行样本前处理及核酸提取，并进行建库及测序。

测序结果表明，阳性样本45份中成功检出39份，阴性样本31份中有2份被判定为阳性，表明，本实施例中的方法的灵敏度和特异性分别为86.7％和93.5％。

实施例3

本实施例中，分别向健康人的尿液中加入已知数量的10倍梯度稀释的大肠杆菌和屎肠球菌，制作尿路感染模拟样本(革兰氏阴性菌和阳性菌分别做)，然后采用实施例1中的方法进行进行样本前处理及核酸提取，宏基因组纳米孔测序进行病原体鉴定，以评价本发明的方法的最低检出限。具体方法为：

1、取一份健康人尿液样本(20ml，无菌操作)，900μl一管等体积分装12管，分别标号EC1-EC6和EF1-EF6。

2、以大肠杆菌为代表制作革兰氏阴性菌尿路感染模拟样本。取OD

3、以屎肠球菌为代表制作革兰氏阳性菌尿路感染模拟样本。取OD

4、将以上12管模拟样本分别取100μl在LB培养基进行涂板，37℃过夜培养并计数。

5、同时将剩余的模拟样本按照实施例1中的进行样本前处理和核酸提取。

6、根据涂板计数结果，分别取10

实验结果如下表5所示，结果表明，本发明的试剂盒，能够检测出10

表5

实施例4

本实施例选取20份已知结果的尿培养阳性样本，经实施例1中的方法进行样本前处理和核酸提取，将提取结果通过三种不同的建库方法(快速建库法，16S扩增子建库，PCR宏基因组建库)进行建库测序，比较三种方法的检出率。

具体实验方法为：

(一)样本前处理及核酸提取：将20份尿培养阳性样本按照实施例1中的方法进行样品的前处理及核酸提取。

(二)建库及上机测序

将步骤(一)中得到的核酸，分成三等份，分别按照下述三种方法进行建库及测序。

方法1、快速建库法(SQK-RBK004,Oxford Nanopore)：

(1)每个样本分别用一个0.2ml的PCR管中按下表配置反应体系

表6

(2)用移液器吹吸混匀，然后30℃反应1分钟，80℃反应1分钟。

(3)将每个样本(不超过6个)的10μl体系加到同一个新的Eppendorf管中。

(4)向上步混合的体系中加入等体积的磁珠进行纯化，最后用10μl 10mM Tris-HCl pH 8.0with 50mM NaCl进行洗脱.

(5)RAP连接和上机测序。

1)向10μl的DNA库中加入1μl的RAP,充分混匀后置于室温孵育5min。向一管FB中加入30μl的FLT,充分震荡混匀，将混合液加载到芯片上，孵育5min。后准备上机文库，体系(75μl)如下：

表7

2)提前连接电脑和测序仪，芯片提前半小时取出放到室温，然后进行芯片自检，自检合格方可上机。

3)用R9.4.1芯片(FLO-MIN106)进行MinION测序。根据制造商的说明，总共75μl的文库DNA被加载到流动池中。MinION仪器运行约2小时。使用ONT MinKNOW GUI软件(version4.2.8)收集原始测序数据并进行实时basecalling。

方法2、16S扩增子建库法(SQK-RAB204,Oxford Nanopore)：

(1)每个样本分别用一个0.2ml的PCR管中按下表配置反应体系

表8

(2)吹吸混匀，按以下程序进行PCR反应。

1)95℃1分钟(1个循环)

2)95℃20秒(25个循环)

3)55℃30秒(25个循环)

4)65℃2分钟(25个循环)

5)65℃5分钟(1个循环)

6)4℃至下一步操作。

(3)将反应完的样本分别转移到一个1.5ml的Eppendorf管中。

(4)向以上每个管中加入30μl磁珠进行纯化，最后分别用10μl Tris-HCl-NaCl进行洗脱，并用Qubit进行浓度测量。

(5)将上步洗脱的DNA库等质量混合到总体积10μl。

(6)RAP连接和上机测序。步骤同上。

方法3、PCR宏基因组建库(SQK-PBK004,Oxford Nanopore)：

(1)每个样本分别用一个0.2ml的PCR管中按下表配置反应体系(末端修复)

表9

(2)用移液器吹吸混匀，然后20℃反应5分钟，65℃反应5分钟。

(3)将反应完的样本分别转移到一个1.5ml的Eppendorf管中。

(4)分别用60μl的磁珠进行纯化然后用16μl的无核酸酶水洗脱。

(5)每个样本分别用一个1.5ml的Eppendorf管中按下表配置反应体系(标签接头连接)

表10

(6)用移液器吹吸10次使其充分混匀，于室温孵育10min。

(7)用20μl的磁珠进行纯化并用25μl无核酸酶的水进行洗脱。

(8)取1μl上步洗脱的DNA进行Qubit浓度测量。

(9)每个样本分别用一个0.2ml的PCR管中按下表配置反应体系(标签连接和PCR扩增)

表11

(10)将以上体系用移液器吹吸10次，使其充分混匀，按以下程序进行PCR反应。

1)95℃反应3分钟(1个循环)

2)95℃反应15秒(15个循环)

3)56℃反应15秒(15个循环)

4)65℃反应2分钟(15个循环)

5)65℃反应6分钟(1个循环)

6)4℃至下一步操作。

(11)用30μl的磁珠进行纯化，最后分别用10μl Tris-HCl-NaCl进行洗脱，并用Qubit进行浓度测量。

(12)将上步洗脱的DNA库等质量混合到总体积10μl。

(13)RAP连接和上机测序。步骤同上。

三、实验结果

比对三种建库方法测得结果与尿液的已知结果进行比较，结果如表12所示，发现，检测的一致率分别为80％/80％和55％。

表12

实施例4

1.取20份随机抽取的尿液样本，每种样本分成两组(每组设3个重复实验)，分别用珠打法和本发明的裂解液进行酶解，具体方法为：

珠打法：取1ml尿液置于1.5ml EP管中，18000×g离心5分钟对病原体进行富集，弃800μl上清至管中剩余200μl。将50μl缓冲液ATL(含试剂DX)加入含有glass beads的病原体裂解管中，将200μl尿液沉淀重悬并全部转移到病原体裂解管中。将病原体裂解管放在带有Microtube Foam Insert的涡旋器上，并以最大速度涡旋振荡5-10分钟。后将罐子取下并10000g离心1分钟，取200μl上清至一个新的ep管中。

酶解法：取1ml尿液置于1.5ml EP管中，18000×g离心5分钟对病原体进行富集，弃800μl上清至管中剩余200μl。然后，加入5μl的lytic enzyme solution(Qiagen)和10μl的MetaPolyzyme(Sigma Aldrich，5MG，用750μl PBS中溶解)，温和翻转混匀6次。混合样品在37℃震荡孵育1h，裂解病原体细胞。

2、将上述两种方法得到破碎或者裂解的细胞，进行核酸提取和浓度测量：根据IndiSpin Pathogen Kit商业试剂盒说明书操作，最后用100μl无核酸酶的水洗脱两遍。DNA纯度和浓度用NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Fisher Scientific)和Qubit 4.0荧光光度计(Thermo Fisher Scientific)结合dsDNA HS Assay kit进行分析。

3、QPCR：对每个样本使用下表中的引物探针，按照下表中的反应体系进行QPCR检测。每个样本三个重复。每次实验严格设置阴性对照。结果如表13所示。

表13

反应体系(25μl)

表14

反应程序

4、建库测序：根据牛津纳米孔技术公司SQK-PBK004试剂盒操作说明进行建库，用MinION结合R9.4.1芯片进行测序。使用ONT MinKNOW GUI软件(version 4.2.8)收集原始测序数据并进行实时basecalling。

表15：部分样本QPCR结果CT值对比表

表16：测序reads占比对比(以培养为标准，只看与培养一致的结果reads数和比例)

结合表和图中的结果可以看出，本发明采用的裂解液能够无差别适用于真菌，革兰氏阳性菌及阴性菌核酸提取；并且与常规的珠打法相比较，本发明的裂解液能够更好的保持所提取基因组的完整性，克服了常规珠打法将基因组过度片段化的不足，从而大大提高了与病原菌无差别裂解与宏基因组测序的适配性，更大的激发了基于宏基因组测序的病原体全面无偏好检测的潜力。

实施例5

随机取6份尿液样本，按照本发明中的检测方法进行检测，通过比较15分钟，30分钟，2小时的目的菌reads数及目的菌reads占比结果，发现随着测序时间延长，目的菌reads数增多的同时其占比并不会有明显提高，如上表所示，此结果表明本发明的方法在测序反应开始15分钟以内便可对致病菌做出准确鉴定。结合样本核酸提取(2小时)，建库测序(2.5小时)，数据分析(0.5小时)时间，我们可以在拿到样本后的5小时以内得出可靠的病原体及耐药基因鉴定结果。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种基于宏基因组纳米孔测序的尿路感染病原体试剂盒及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtataaggg atcaaaaatg agagcca 27

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctctgaggc cttgctcctg 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgatggcctt ggttgaga 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgtttgag cgtcrttt 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcctccgctt attgatat 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgagcgaact agacttt 17

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttggtattt tgcatgytgc tctc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcgccccttg cctctc 16

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tgggcttggg actct 15

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgcagataat tcacgcccag 20

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

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<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgctcatctg tttcgc 16