一种鲁米诺化学发光体系及其应用

技术领域

本发明涉及化学发光分析方法技术领域，尤其是涉及一种鲁米诺化学发光体系及其应用。

背景技术

已有的鲁米诺化学发光共反应剂包括以下几种类型：(1)过氧化氢：为了得到较高的发光强度，金属纳米粒子等被用于催化鲁米诺化学发光以提高发光强度，最终提高待测物检测灵敏度，如制备金纳米粒子催化鲁米诺-铁氰化钾体系的化学发光(Journal ofLuminescence,2014,154,350-355)；(2)其他强氧化剂如高锰酸钾、次氯酸盐、二氧化硫脲、铁氰化钾、N-羟基邻苯二甲酰亚胺作为共反应剂(Biosensors and Bioelectronics,2018,99,519-524)等。

现有鲁米诺化学发光体系，共反应剂基于过氧化氢作为共反应物的体系，有以下缺点：(1)过氧化氢溶液不稳定，使用时要注意现用现配，不便于实验操作；(2)鲁米诺-过氧化氢体系的发光强度较低，对基于该体系的待测物检测灵敏度较差，且连续测定重现性较差，较难考量实验真值；(3)为了增强发光强度，体系中往往加入金属纳米粒子或者过度金属离子及复合物，这种做法不仅增加了成本，也使反应体系更加复杂。使用其他单一氧化型试剂作为鲁米诺共反应剂，包括高锰酸钾、重铬酸钾、次氯酸盐、青蒿素等，获得较强化学发光往往需要配合较高鲁米诺浓度，提高了成本。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种鲁米诺化学发光体系，本发明提供的鲁米诺化学发光体系可以无需添加催化剂即可与鲁米诺化学发光产生强的化学发光。

本发明提供了一种鲁米诺化学发光体系，包括：发光体和发光共反应试剂；

所述发光体为鲁米诺-缓冲溶液；所述发光共反应试剂为乙酰丙酮氧钒水溶液。

优选的，所述缓冲溶液选自氢氧化钠、磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液或氢氧化钾中的一种。

优选的，所述鲁米诺-缓冲溶液中鲁米诺的浓度为0.1nM～100μM；

所述鲁米诺-缓冲溶液中缓冲溶液的浓度为20mM～200mM，

所述乙酰丙酮氧钒水溶液的浓度为1μM～1000μM。

本发明提供了乙酰丙酮氧钒作为鲁米诺化学发光共反应试剂的应用。

本发明提供了一种流动注射化学发光检测系统，包括：

与所述鲁米诺-缓冲溶液储备液连接的第一流通管路；

与所述超纯水连接的第二流通管路；

分别与所述第一流通管路和第二流通管路相连的流动注射装置；

设置与所述与以上两管路同步的进样阀；

分别与所述第一流通管路和第二流通管路相连的检测器。

本发明提供了一种抗坏血酸、L-半胱氨酸或金属离子的定量检测方法，包括：

将乙酰丙酮氧钒与待测物混合，注入检测系统中，与鲁米诺-缓冲溶液、水溶液混合，反应，发光，通过发光强度的变化测定得到待测物的浓度。

优选的，所述鲁米诺-缓冲溶液的流速为1mL/min～5mL/min；所述水溶液的流速为1mL/min～5mL/min。

优选的，所述鲁米诺-缓冲溶液中鲁米诺的浓度为0.1nM～100μM；

所述鲁米诺-缓冲溶液中缓冲溶液的浓度为20mM～200mM，

所述乙酰丙酮氧钒水溶液的浓度为1μM～1000μM。

与现有技术相比，本发明提供了一种鲁米诺化学发光体系，包括：发光体和发光共反应试剂；所述发光体为鲁米诺-缓冲溶液；所述发光共反应试剂为乙酰丙酮氧钒。本发明首次采用乙酰丙酮氧钒作为鲁米诺化学发光反应的共反应剂，结合流动注射方法得到高效的化学发光。解决了传统鲁米诺-过氧化氢化学发光体系发光效率低的问题，同时乙酰丙酮氧钒水溶液储备液在室温下可连续数天保持性状，对比过氧化氢水溶液使用中需要现用现配的问题，极大方便了实验操作环节，在一定程度上也减少了不同批次实验产生的误差。本发明的鲁米诺-乙酰丙酮氧钒化学发光体系可用于抗坏血酸、L-半胱氨酸或Cu

附图说明

图1不同组分化学发光强度对比图；

图2不同NaOH浓度发光强度点线图；

图3不同流速发光强度点线图；

图4不同乙酰丙酮氧钒浓度发光强度点线图；

图5不同鲁米诺浓度发光强度点线图；

图6抗坏血酸对体系干扰化学发光强度对比图；

图7定量检测抗坏血酸线性图；

图8化学发光检测管路简图；其中A为超纯水管路；B为鲁米诺-NaOH溶液管路；C为预混池；D为乙酰丙酮氧钒进样阀；E为信号检测系统。

具体实施方式

本发明提供了一种鲁米诺化学发光体系及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种鲁米诺化学发光体系，包括：发光体和发光共反应试剂；

所述发光体为鲁米诺-缓冲溶液；所述发光共反应试剂为乙酰丙酮氧钒水溶液。

本发明所述鲁米诺化学发光体系包括发光体；所述发光体为鲁米诺-缓冲溶液。

其中，所述缓冲溶液选自氢氧化钠、磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液或氢氧化钾中的一种；优选为氢氧化钠。

本发明所述鲁米诺-缓冲溶液中鲁米诺的浓度优选为0.1nM～100μM；特别优选为1μM。

所述鲁米诺-缓冲溶液中缓冲溶液的浓度优选为20mM～200mM；特别优选为80mM。

本发明人发现，乙酰丙酮氧钒作为发光共反应剂，发光强度是过氧化氢的55.1倍，而乙酰丙酮氧钒和过氧化氢混合作为发光共反应剂，发光更强，达到过氧化氢的64倍，效果更优。

本发明所述鲁米诺化学发光体系包括发光共反应试剂；所述发光共反应试剂为乙酰丙酮氧钒。

其中，所述乙酰丙酮氧钒水溶液的浓度优选为1μM～1000μM；特别优选为500μM。

本发明提供了乙酰丙酮氧钒作为鲁米诺化学发光共反应试剂的应用。

将乙酰丙酮氧钒发展为鲁米诺化学发光的新型共反应剂。它可以无需添加催化剂即可与鲁米诺化学发光产生强的化学发光。

本发明提供了一种流动注射化学发光检测系统，包括：

与所述鲁米诺-缓冲溶液储备液连接的第一流通管路；

与所述水溶液连接的第二流通管路；

分别与所述第一流通管路和第二流通管路相连的流动注射装置；

设置与所述第一流通管路上的进样阀；

分别与所述第一流通管路和第二流通管路相连的检测器。

本发明提供的一种流动注射化学发光检测系统包括与所述鲁米诺-缓冲溶液储备液连接的第一流通管路；本发明对于所述具体的管路规格不进行限定。

本发明上述鲁米诺-缓冲溶液储备液的组分和浓度已经有了清楚的描述，在此不再赘述。

本发明提供的一种流动注射化学发光检测系统包括与所述水溶液连接的第二流通管路。

分别与所述第一流通管路和第二流通管路相连的流动注射装置。

通过流动注射装置控制流速，可以更好地测定。

本发明提供的一种流动注射化学发光检测系统包括设置与所述第一流通管路上的进样阀。

本发明乙酰丙酮氧钒和待测物均通过进样阀进入上述检测系统。

本发明提供的一种流动注射化学发光检测系统包括分别与所述第一流通管路和第二流通管路相连的检测器。

本发明上述检测器包括发光池和光电倍增管。

同时检测器外接化学发光仪，用来控制所述检测器的电压。

本发明提供了一种抗坏血酸、L-半胱氨酸或金属离子的定量检测方法，包括：

将乙酰丙酮氧钒与待测物混合，注入检测系统中，与鲁米诺-缓冲溶液、水溶液混合，反应，发光，通过发光强度的变化测定得到待测物的浓度。

本发明上述检测方法可以对于抗坏血酸、L-半胱氨酸或金属离子进行定量检测，其中金属离子包括但不限于Cu

本发明上述检测方法首先将乙酰丙酮氧钒与待测物混合，注入检测系统中，与鲁米诺-缓冲溶液、水溶液混合。

即为将乙酰丙酮氧钒与待测物混合，通过进样阀注入检测系统中，与第一流通管路中的鲁米诺-缓冲溶液储备液混合，再与第二流通管路中的水混合，最后在检测器中反应，发光，通过发光强度的变化测定得到待测物的浓度。

本发明的鲁米诺-乙酰丙酮氧钒在流动注射发光池中混合后，反应发光，通过光电倍增管检测，得到发光强度。在待测物的检测中，首先将乙酰丙酮氧钒与待测物在离心管中预混合，混合均匀后立即通过进样阀注射，与鲁米诺反应，通过发光强度的变化确定待测物浓度，以达到待测物定量检测。

鲁米诺-缓冲溶液、水溶液混合，

本发明所述鲁米诺-缓冲溶液中鲁米诺的浓度优选为0.1nM～100μM；更优选为50nM～5μM；最优选为200nM～1μM；特别优选为1μM。

所述鲁米诺-缓冲溶液中缓冲溶液的浓度优选为20mM～200mM；更优选为30mM～150mM；最优选为60mM～100mM；特别优选为80mM。

所述乙酰丙酮氧钒水溶液的浓度优选为1μM～1000μM；更优选为10μM～1mM；最优选为50μM～500μM；特别优选为500μM。

按照本发明，所述鲁米诺-缓冲溶液的流速为1mL/min～5mL/min；更优选为1.5mL/min～4mL/min；最优选为2mL/min～3mL/min；特别优选为2.5mL/min；所述水溶液的流速为1mL/min～5mL/min；更优选为1.5mL/min～4mL/min；最优选为2mL/min～3mL/min；特别优选为2.5mL/min。

本发明提供了一种鲁米诺化学发光体系，包括：发光体和发光共反应试剂；所述发光体为鲁米诺-缓冲溶液；所述发光共反应试剂为乙酰丙酮氧钒水溶液。本发明首次采用乙酰丙酮氧钒作为鲁米诺化学发光反应的共反应剂，结合流动注射方法得到高效的化学发光。解决了传统鲁米诺-过氧化氢化学发光体系发光效率低的问题，同时乙酰丙酮氧钒水溶液储备液在室温下可连续数天保持性状，对比过氧化氢水溶液使用中需要现用现配的问题，极大方便了实验操作环节，在一定程度上也减少了不同批次实验产生的误差。本发明的鲁米诺-乙酰丙酮氧钒化学发光体系可用于抗坏血酸、L-半胱氨酸或金属离子Cu

本发明使用的乙酰丙酮氧钒试剂，价格低廉，溶液性质稳定。作为单一化学发光共反应剂，操作简单、无纳米材料合成等复杂步骤和工艺。在光电倍增管电压较低情况下就可以得到很高的发光强度，并且数据重现性好，准确度高，结合流动注射分析方法，可实现样品连续稳定测量。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种鲁米诺化学发光体系及其应用进行详细描述。

发光池制作：

使用激光雕刻机在直径50mm厚10mm的聚四氟板上雕刻出溶液流动槽。包括两个进样孔，一个出样孔，孔径均1.5mm，插入内径0.8mm塑料管连接外部进样软管。流动槽宽度1.5mm，总长度190mm。底部采用直径44mm，厚度4mm透明有机玻璃，聚四氟板和透明有机玻璃用6颗螺丝紧密固定，组成化学发光反应及发光检测场所，放置在暗箱中。

各种储备液制备：

NaOH溶液：取10gNaOH固体溶解在150mL左右超纯水中，充分搅拌后250mL定容，浓度为1M，可长期使用，常温避光保存。

乙酰丙酮氧钒溶液：取0.0106g乙酰丙酮氧钒溶解在40mL超纯水中，多次振荡溶解，浓度1mM，可使用7-10天，常温避光保存。

鲁米诺溶液：取3.5432g鲁米诺溶解于500mL，0.1MNaOH溶液中，浓度10mM，贮备液于冰箱中冷藏，现用现取。

实验管路说明：

流动注射泵连接两条管路，一条接入超纯水瓶，一条接入鲁米诺-NaOH缓冲溶液瓶；两个管路分别连接流动注射发光池的两个进样管，进过发光池后，通过出样管流出。乙酰丙酮氧钒等发光同反应剂(每次200μL)通过阀门开关控制注射到反应体系内，注射阀于暗箱外侧壁，与两个管路溶液混合后进入发光池进样管。

实施例1：

不同组分发光强度对比实验：

两个进样瓶，一个充满超纯水，另一个将32mLNaOH储备液、40μL鲁米诺储备液按顺序加入368mL超纯水中，混合均匀；连接好管路，光电倍增管电压调至600V，打开流动注射泵调至流速2.5mL/min。

1μM鲁米诺(空白)：发光程序开始运行，将200μL超纯水通过进样阀加入发光池反应，连续测量3次，记录发光强度；

1μM鲁米诺+500μM过氧化氢：将200μL浓度为500μM过氧化氢在发光程序运行10s、90s、170s时通过进样阀加入发光池反应，250s停止程序运行，记录3次发光强度；

1μM鲁米诺+500μM乙酰丙酮氧钒：将200μL浓度为500μM乙酰丙酮氧钒在发光程序运行10s、90s、170s时通过进样阀加入发光池反应，250s停止程序运行，记录3次发光强度；

1μM鲁米诺+500μM乙酰丙酮氧钒+500μM过氧化氢：将1mM乙酰丙酮氧钒2mL，1mM过氧化氢2mL充分混合后，立即运行发光程序，将200μL混合溶液在发光程序运行10s、90s、170s时通过进样阀加入发光池反应，250s停止程序运行，记录3次发光强度。

表1

由发光数据分析可知，乙酰丙酮氧钒作为发光共反应剂，发光强度是过氧化氢的55.1倍，而乙酰丙酮氧钒和过氧化氢混合作为发光共反应剂，虽然发光更强，达到过氧化氢的64倍，考虑到简化试剂组分和提高稳定性，乙酰丙酮氧钒单独作为鲁米诺化学发光的共反应剂就足以实现高效化学发光。

实施例2：

条件优化实验(pH值优化)

两个进样瓶，一个充满超纯水，另一个将500μL鲁米诺储备液加入50mL不同浓度NaOH溶液中(配比见表2)，混合均匀，最终浓度为100μM；连接好管路，光电倍增管电压调至500V，打开流动注射泵调至流速2mL/min。

不同浓度NaOH浓度下，将200μL浓度为1mM乙酰丙酮氧钒在发光程序运行10s、90s、170s时通过进样阀加入发光池反应，250s停止程序运行，分别记录3次发光强度。

表2 50mL不同浓度NaOH溶液配比

表3不同NaOH浓度化学发光强度

由数据可知，NaOH浓度为80mM为实验最佳反应条件之一。

实施例3：

流速优化实验

两个进样瓶，一个充满超纯水，另一个将3mL鲁米诺储备液加入80mMNaOH浓度溶液中，混合均匀，汇合后体积为300mL，最终鲁米诺浓度为100μM；连接好管路，光电倍增管电压调至500V，打开流动注射泵调至流速分别为1mL/min、1.5mL/min、2mL/min、2.5mL/min、3mL/min、4mL/min和5mL/min。

不同流速下，将200μL浓度为1mM乙酰丙酮氧钒在发光程序运行10s、90s、170s时通过进样阀加入发光池反应，250s停止程序运行，分别记录3次发光强度。

表4不同流速下化学发光强度

由实验数据可知，流速为2.5mL/min为实验最佳反应条件之一。

实施例4：

乙酰丙酮氧钒浓度优化实验

两个进样瓶，一个充满超纯水，另一个将4mL鲁米诺储备液加入80mMNaOH浓度溶液中，混合均匀，汇合后体积为400mL，最终鲁米诺浓度为100μM；连接好管路，光电倍增管电压调至500V，打开流动注射泵调至流速为2.5mL/min。

将不同浓度200μL乙酰丙酮氧钒在发光程序运行10s、90s、170s时通过进样阀加入发光池反应，250s停止程序运行，分别记录3次发光强度。

表5不同乙酰丙酮氧钒浓度下化学发光强度

由实验数据可知，发光强度随乙酰丙酮氧钒浓度增加而增强，考虑该物质在水中溶解度以及本着节省试剂用量的原则，选择500μM为乙酰丙酮氧钒的最佳反应浓度之一。

实施例5：

鲁米诺浓度优化实验

两个进样瓶，一个充满超纯水，另一个为不同浓度鲁米诺-80mM NaOH混合溶液50mL；连接好管路，光电倍增管电压调至600V，打开流动注射泵调至流速为2.5mL/min。

将200μL浓度为500μM乙酰丙酮氧钒在发光程序运行10s、90s、170s时通过进样阀加入发光池反应，250s停止程序运行，分别记录3次发光强度。

不同浓度鲁米诺配置原则如下：

取10mM鲁米诺母液10μL稀释至1mL，最终浓度为100μM；取100μM鲁米诺溶液10μL稀释至1mL，最终浓度为1μM；取1μM鲁米诺溶液10μL稀释至1mL，最终浓度为10nM；取10nM鲁米诺溶液10μL稀释至1mL，最终浓度为0.1nM。其他浓度鲁米诺溶液采用以上四个浓度的溶液就近配制。

表6不同鲁米诺浓度下化学发光强度

由实验数据可知，发光强度随鲁米诺浓度增加而增强，而该发光仪在光子数值200000左右到达峰值，信号会溢出。综合考虑信号强度、稳定性及鲁米诺试剂的用量，选定1μM为鲁米诺的优化浓度之一。

实施例6：

抗坏血酸对发光体系干扰实验

两个进样瓶，一个充满超纯水，另一个将8mLNaOH储备液、10μL鲁米诺储备液按顺序加入92mL超纯水中，混合均匀；连接好管路，光电倍增管电压调至600V，打开流动注射泵调至流速2.5mL/min。

鲁米诺-乙酰丙酮氧钒发光：将200μL浓度为500μM的乙酰丙酮氧钒在发光程序运行10s、90s、170s时通过进样阀加入发光池反应，250s停止程序运行，分别记录3次发光强度；

抗坏血酸对发光体系影响：将1mM乙酰丙酮氧钒2mL，1mM抗坏血酸2mL充分混合后，立即运行发光程序，将200μL混合溶液在发光程序运行10s、250s、490s(反应时间延长，后续加样时间由发光降为初始值的间隔决定)时通过进样阀加入发光池反应，730s停止程序运行，记录3次发光强度。

表4抗坏血酸对发光体系影响

由数据可知抗坏血酸降低了发光强度99％。

实施例7：

抗坏血酸线性检测实验

两个进样瓶，一个充满超纯水，另一个将3mL鲁米诺储备液加入80mMNaOH浓度溶液中，混合均匀，汇合后体积为300mL，最终鲁米诺浓度为100μM；连接好管路，光电倍增管电压调至600V，打开流动注射泵调至流速2.5mL/min。

鲁米诺-乙酰丙酮氧钒发光：将200μL浓度为500μM的乙酰丙酮氧钒在发光程序运行10s、90s、170s时通过进样阀加入发光池反应，250s停止程序运行，分别记录3次发光强度；

抗坏血酸定量线性检测实验：将1mM乙酰丙酮氧钒1mL，不同浓度(分别为1μM、2.5μM、5μM、25μM、50μM和100μM)抗坏血酸1mL充分混合后，立即运行发光程序，将200μL混合溶液在发光程序运行10s、90s、170s时通过进样阀加入发光池反应，250s停止程序运行，记录3次发光强度。

经计算，线性方程为y＝23720-11742logc

y为不同抗坏血酸浓度下发光强度，c为抗坏血酸浓度，单位μM。该化学发光方法在抗坏血酸浓度为1μM至100μM之间，可实现线性检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。