一种调控杨树木质部发育的钙调素PdCaM247基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种调控杨树木质部发育的钙调素PdCaM247基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

杨树(Populus)属于杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus L.)，乔木树干通直。因其具有生长速度快、木材用途广等特性，是世界人工林发展的三大速生树种之一。木材作为一种重要的生物质能源，有望随着社会经济的发展而增加使用率。以生物质为原料生产的能源约占世界一次能源的14％。虽然中国目前拥有全世界面积最大的杨树人工林，但中国又作为世界上最主要的木材加工、生产进出口国，对外木材依赖度超过50％。通过培育速生优质人工林新品种，提高有限造林地的木材产量和质量显得尤为重要。但是，由于林木生长周期长、杂合度高等诸多自身生物学特性的限制，迄今对木材材性的遗传背景知之甚少，制约了人工林优质、高产目标的实现。

维管形成层维持着木材径向生长，它高度复杂和动态化，向内细胞经历扩张、程序化死亡形成次生木质部，向外产生次生韧皮部。揭示木材形成的遗传调控机理，不但可以丰富树木分子生物学理论，而且可以为采用分子育种技术对树木的材性改良提供理论支持。

林木形成层活动及次生维管组织发育受到多种外界环境因子及内源激素的协同作用，而钙离子信号作为细胞信号转导的第二信使，响应植物生长、生物和非生物胁迫反应。钙调素(Calmodulin，CaM)是植物中Ca

因此，研究钙调素调控木材形成的分子机制，筛选调控形成层活动和木材形成的特异PdCaM247基因，对了解钙调素调控形成层活动和木材产量以及杨树基因工程育种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能调控杨树木质部发育的基因PdCaM247，并利用其表达载体转化杨树，以期促进林木分子育种技术的发展，为优良树种的培育或筛选提供技术手段，同时为探索木质部发育的分子机理奠定基础。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种调控杨树木质部发育的钙调素PdCaM247基因，其编码区核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

优选地，所述钙调素PdCaM247基因的CDS全长450bp，编码149个氨基酸和1个终止密码子。

本发明的另一目的是提供上述调控杨树木质部发育的钙调素PdCaM247基因的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

PdCaM247基因的特异性启动子驱动GUS转化杨树，获得转基因植株。

在强启动子35S后插入木质部优势表达基因PdCaM247，得到过表达载体，转化杨树，获得过表达植株。

在具体研究过程中，利用上述载体通过农杆菌介导法转化银腺杨84K(Populusalba×Populus glandulosa)，分别获得了PdCaM247特异性启动子株系和过表达株系。

对上述所得不同转基因株系进行表型及显微形态观察发现，PdCaM247在根茎叶均有表达，但主要在维管形成层高表达量；PdCaM247过表达株系显著变矮，木质部显著加宽。

以上研究结果证明，PdCaM247对杨树株高及木质部发育具有关键调控作用，其在林木分子育种及优良品种选育中具有重要应用价值。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明以美洲黑杨丹红杨(Populus deltoides‘Danhong’)为材料，筛选鉴定出了PdCaM247基因，基于其过表达的表型鉴定表明，其能够调控杨树木质部发育，说明PdCaM247基因是调控杨树木质部发育的关键调节因子，为木质部发育的调控手段提供了新的选择，在林木基因工程领域有重要应用价值。

下面通过具体实施方式和附图对本发明作进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1为本发明实施例1中丹红杨PdCaM247基因的组织表达特性分析图。

图2-1为本发明实施例1中ProPdCaM247::GUS转基因植株全株GUS染色图。

图2-2为本发明实施例1中ProPdCaM247::GUS转基因植株叶片GUS染色图。

图2-3为本发明实施例1中ProPdCaM247::GUS转基因植株茎切片GUS染色图。

图2-4为本发明实施例1中ProPdCaM247::GUS转基因植株根GUS染色图。

图2-5为本发明实施例1中ProPdCaM247::GUS转基因植株根切片GUS染色图。

图3-1为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247的转基因杨树的阳性植株检测图。

图3-2为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247的转基因杨树的转录水平定量检测图。

图4-1为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因植株表型。

图4-2为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因植株株高统计。

图4-3为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因植株地径统计。

图4-4为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因植株节间数量和节间长度统计。

图5-1为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树第4、6、10节间木质部组织切片。

图5-2为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树第4节间木质部宽度统计。

图5-3为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树第6节间木质部宽度统计。

图5-4为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树第10节间导管数量统计。

图5-5为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树纤维细胞长度统计。

图5-6为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树导管细胞长度统计。

图5-7为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树第10节间相同面积内导管数量。

图5-8为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树第10节间导管直径统计。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以下实施例中未进行详细说明的操作可参照分子克隆，相关试剂盒使用说明的操作实现。

除非特别说明，下面实施例中所涉及的试剂均为市场上可购的常规试剂，所用的方法均为本技术领域常用的方法。

实施例1：

一、杨树PdCaM247基因的克隆

以美洲黑杨良种丹红杨为材料，使用RNAprep Pure Plant Plus Kit试剂盒(Tiangen，Beijing，China)提取其木质部总RNA；每个样品取1.0μg RNA，通过使用SuperScript III first-strand synthesis system(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)合成cDNA第一链，参考已发表毛果杨基因组序列，使用Primer5软件设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，进行基因全长扩增，引物中引入GATEWAY接头；

其中，PdCaM247 ORF正向引物PdCaM247-CDS-F如序列表中SEQ ID NO.1所示(表1)，反向引物PdCaM247-CDS-R如SEQ ID NO.2(表2)所示：

表1

表2

PCR反应体系如下：TaKaRa高保真扩增酶混合液PrimeSTAR 12.5μl，PdCaM247ORF正向引物PdCaM247-CDS-F(10μM)1μl，反向引物PdCaM247-CDS-R(10μM)1μl，模板(84K杨cDNA)1μl，无菌ddH

表3

表4

二.组织表达特性分析

1.荧光定量PCR

植物材料来自大田1年生丹红杨植株的各个组织和器官，包括以下几个部分，速生期的发育中木质部(Xylem)、韧皮部(Phloem)、未完全展开叶片(Leaf)、顶端分生组织(SAM)、经茎段水培的根(Root)。

上述每一个样品都包含三个生物学重复，所有的植物材料均用液氮速冻后保存于-80℃冰箱中备用，提取样品RNA，反转录合成cDNA，以杨树肌动蛋白(ACTIN)作为内参基因，采用定量PCR分析PdCaM247基因的组织表达特性，扩增引物为PdCaM247-RT-F(SEQ IDNO.5)，见表5，PdCaM247-RT-R(SEQ ID NO.6)，见表6：

表5

表6

实时荧光定量PCR反应体系如下(10μl反应体系)：

如图1所示，为本发明实施例1中丹红杨PdCaM247基因的组织表达特性分析图；通过荧光定量PCR分析发现，PdCaM247基因在不同组织中表达量存在差异，在木质部中有相对较高的表达丰度，而且木质部的表达量明显高于韧皮部，因此，推测该基因在次生木质部形成调控方面可能发挥重要的作用。

2.GUS(β-葡萄糖苷酸酶，β-glucuronidase)染色

(1)PdCaM247启动子载体构建

以丹红杨叶片为材料，使用CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵，Hexadecyltrimethyl ammonium Bromide)提取总DNA，参考毛果杨和美洲黑杨基因组，设计引物(扩增起始密码子上游1500bp)，进行启动子克隆(引入GATEWAY接头)，其中，proPdCaM247启动子正向引物ProPdCaM247-F如序列表中SEQ ID NO.7所示(表7)，反向引物ProPdCaM247-R如SEQ ID NO.8(表8)所示；利用GATEWAY技术，构建PdCaM247启动子GUS载体，将proPdCaM247构建到入门载体PDNOR222.1；反应体系为PCR产物80ng；PDNOR222.1载体0.4μl；BP酶(货号：invitrogen 11789020)0.6μl；无菌ddH

从筛选培养板上挑取阳性克隆，进行PCR检测及测序验证，带PdCaM247启动子的入门载体通过MluI限制性内切酶线性化后，与植物表达载体PMDC164进行LR反应，反应体系为：线性化已连接PdCaM247启动子的PDNOR222.1载体50ng；PMDC164载体75ng；LR酶(货号：invitrogen 11791020)0.6μl；水补足至5μl，反应条件：25℃反应5h；构建ProPdCaM247::GUS；

表7

表8

(2)PdCaM247启动子的遗传转化

通过电击法，将所构建的启动子表达载体(ProPdCaM247::GUS)转入农杆菌GV3101中，通过农杆菌介导的遗传转化，转入杨树愈伤，转化步骤如下：用于遗传转化的84K杨愈伤，在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μM m-2s-1的条件下培养，含有目的表达载体的农杆菌在OD600＝0.6～0.8时侵染愈伤，浸染后的愈伤，放在不定芽诱导培养基(L&M，Lloyd&McCown Woody Plant Basal Medium with Vitamins)基本培养基上，在温度为22±2℃的黑暗条件下共培养3天，共培养后的叶片转移至含有添加0.5mg/l的6-苄基氨基嘌呤(6-benzyl aminopurine)(6-BA)和0.05mg/l萘乙酸(naphthaleneacetic acid)(NAA))、3mg/L潮霉素(hygromycin B)和200mg/L特美汀(Timentin)的L&M上，在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μMm-2s-1的条件下，诱导和筛选抗性不定芽，经过30～45天的诱导培养，将抗性不定芽转移至含有3mg/L潮霉素(hygromycin B)和200mg/L特美汀(Timentin)的生根培养基中(1/2Murashige and Skoog(MS)基本培养基添加0.05mg/L IBA和0.02mg/L NAA)，直至诱导生根。

(3)GUS组织染色

首先，取生长4-5周的ProPdCaM247::GUS的转基因植株，整株放置于90％(体积)的丙酮固定液中，4℃过夜；配置GUS染色缓冲液(0.2M的磷酸二氢钠，0.2M的磷酸氢二钠，2.0mM的铁氰化钾，2.0mM的亚铁氰化钾，现用现配)，将过夜后的转基因植株，用GUS染色缓冲液在冰上洗涤3次；然后配置GUS染色液，取0.005218g的X-Gluc(Gold Biotech，G1281C1)，先溶于1mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，随后，溶于100mL的GUS染色缓冲液中，并向其中加入0.2v％的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，现配现用，随后，将转基因植株完全浸泡在GUS染色液中，抽真空30min；抽真空结束后，将其置于37℃染色12h，随后用70v％乙醇脱色，相机拍照并观察整个植株不同组织的染色结果；取脱色后材料的茎，将其固定于5-6v％琼脂中，静止凝固后，利用震荡切片机切片，然后，利用奥林巴斯显微镜对不同组织中GUS信号的定位进行观察；

如图2-1所示，为本发明实施例1中ProPdCaM247::GUS转基因植株全株GUS染色图；如图2-2所示，为本发明实施例1中ProPdCaM247::GUS转基因植株叶片GUS染色图；如图2-3所示，为本发明实施例1中ProPdCaM247::GUS转基因植株茎切片GUS染色图；如图2-4所示，为本发明实施例1中ProPdCaM247::GUS转基因植株根GUS染色图；如图2-5所示，为本发明实施例1中ProPdCaM247::GUS转基因植株根切片GUS染色图；其中，PdCaM247基因在根、茎、叶均有表达，其中在茎、根的维管形成层积累明显。因此，推测该基因在维管形成层分化和次生木质部形成调控方面可能发挥重要的作用。

三、PdCaM247基因植物表达载体构建

利用GATEWAY技术，构建PdCaM247基因的过量表达载体，使用特异PCR引物，以丹红杨木质部cDNA为模板，进行PCR扩增，将PdCaM247基因ORF构建到入门载体PDNOR222.1；

从筛选培养板上挑取阳性克隆进行PCR检测及测序验证，带PdCaM247基因的入门载体通过MluI限制性内切酶线性化后，与植物表达载体PMDC32进行LR反应，PdCaM247基因导入植物表达载体PMDC32中，得到过量表达载体(35S::PdCaM247)，在PdCaM247基因的5’端组装有强表达启动子CaMV35S，它能使PdCaM247基因在杨树体内高效表达；在PdCaM247基因的3’端组装有强终止子NOS，可有效终止PdCaM247基因的转录。

四、PdCaM247基因的遗传转化与检测

1.PdCaM247基因过量表达的遗传转化

通过电击法，将所构建的过表达载体(35S::PdCaM247)转入农杆菌GV3101中，通过农杆菌介导的遗传转化，转入杨树愈伤，转化步骤如下：用于遗传转化的84K杨愈伤，在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μMm-2s-1的条件下培养，含有目的表达载体的农杆菌在OD600＝0.6～0.8时侵染愈伤，浸染后的愈伤，放在不定芽诱导培养基(L&M，Lloyd&McCown Woody Plant Basal Medium with Vitamins)基本培养基上，在温度为22±2℃的黑暗条件下共培养3天，共培养后的叶片转移至含有添加0.5mg/l的6-苄基氨基嘌呤(6-benzyl aminopurine)(6-BA)和0.05mg/l萘乙酸(naphthaleneacetic acid)(NAA))、3mg/L潮霉素(hygromycin B)和200mg/L特美汀(Timentin)的L&M上，在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μM m-2s-1的条件下，诱导和筛选抗性不定芽，经过30～45天的诱导培养，将抗性不定芽转移至含有3mg/L潮霉素(hygromycin B)和200mg/L特美汀(Timentin)的生根培养基中(1/2Murashige and Skoog(MS)基本培养基添加0.05mg/L IBA和0.02mg/L NAA)，直至诱导生根。

2.过表达转基因植株检测

获得抗性的PdCaM247基因过表达84K杨和野生型植株，提取基因组DNA，利用PCR扩增表达载体上抗性基因，能够扩增得到清晰条带，即为转基因植株；选取转基因植株的茎段，以野生型茎段为对照，提取总RNA并反转录，进行PdCaM247基因定量分析，以确定转基因植株目的基因表达量，定量引物为PdCaM247-RT-F(SEQ ID NO.5)，PdCaM247-RT-R(SEQ IDNO.6)。

如图3-1所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247的转基因杨树的阳性植株检测图；如图3-2所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247的转基因杨树的转录水平定量检测图；其中，PdCaM247基因在过量表达转基因株系OE-1、OE-5的表达量分别是野生型84K的32.4、20.9倍。

五、PdCaM247转基因植株表型观察

将PdCaM247过表达植株和野生型84K杨，同时种植在温室中，共种三批，并分别对不同批次的植株进行表型测定和拍照，如图4-1所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因植株表型；如图4-2所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因植株株高统计；如图4-3所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因植株地径统计；如图4-4所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因植株节间数量和节间长度统计；在本发明实施例1中，对2个月龄野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树株高表型比较，图4-1显示了移栽两个月后的表型照片，与非转基因84K杨植株相比，过表达植株表现出株高变矮、地径增粗的表型；过量表达84K株高为54.5cm，显著低于野生型84K的72.1cm，同时，地径略粗于野生型84K，但不显著(图4-1至图4-3)；对节间数量和长度进行统计发现，野生型和过量表达的各节间长度无明显差异，但过量表达植株仅有15-17节间(图4-4)。

六、PdCaM247过量表达转基因株系木质部切片观察

对PdCaM247过量表达和野生型84K的4、6、10节间进行震荡切片观察。

1.取0.5cm长的土培苗杨树地面以上2cm处茎段，经LOCTITE 495胶水固定在振荡切片机莱卡(Leica)VT1200S切片槽内后，切成50μm厚度的横切面切片，切片保存于70％酒精中；

2.组织化学染色及拍照观察分析：将新鲜切片进行0.05％甲苯胺蓝O(toluidineblue O,简称TBO)TBO染色1min后，用水清洗三次，以清除浮色和多余的染色液，盖上盖玻片，采用Olympus BX51普通光学显微镜，对经TBO染色的切片进行观察，拍照，以分析茎段横截面的形态变化，如果如图5-1至图5-7所示，如图5-1所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树第4、6、10节间木质部组织切片；如图5-2所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树第4节间木质部宽度统计；如图5-3所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树第6节间木质部宽度统计；如图5-4所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树第10节间导管数量统计；如图5-5所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树纤维细胞长度统计；如图5-6所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达PdCaM247转基因杨树导管细胞长度统计；对第4、6、10节间进行震荡切片观察和木质部宽度统计，发现转基因植株木质部显著增宽，木质部细胞层数显著多于野生型84K。这些结果表明PdCaM247正向调控木质部发育(图5-1至图5-4)；同时发现PdCaM247过表达引起木质部导管直径增加，但导管数量减少(图5-7至图5-8)。因此，对纤维细胞、导管细胞形态测定，发现其形态发生了变化，虽然过表达转基因株系株高显著低于野生型84K，但纤维和导管细胞长度反而大于84K(图5-5至图5-6)，这可能是影响木质部增粗的重要原因。

对上述所得不同转基因株系进行表型及显微形态观察发现，PdCaM247过表达株系株高显著变矮，木质部显著加宽。以上研究结果证明，PdCaM247对杨树株高及木质部发育具有关键调控作用，其在林木分子育种及优良品种选育中具有重要应用价值。

虽然以上对本发明目的构思和实施例作了详尽说明，但本领域普通技术人员可以认识到，在没有脱离权利要求限定范围的前提条件下，仍然可以对本发明做出各种改进和变换，而这种改进和变换仍然应当属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院林业研究所

<120> 一种调控杨树木质部发育的钙调素PdCaM247基因及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(正向引物PdCaM247-CDS-F)

<400> 1

ggggacaact ttgtacaaaa aagttggaat ggcggatcaa ttgacgg 47

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(反向引物PdCaM247-CDS-R)

<400> 2

ggcggccgca caactttgta caagaaagtt gggtatcact tagccatcat aaccttgac 59

<210> 3

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列(PdCaM247)

<400> 3

atggcggatc aattgacgga tgaccagatc tccgagttca aggaagcttt cagtttgttc 60

gataaggatg gtgatggttg catcaccacc aaggaattgg ggactgtcat gagatcgcta 120

ggacagaacc caactgaggc agaactccag gacatgatta acgaggttga tgctgatgga 180

aatggtacca ttgattttcc tgagttcctg aacctcatgg caaggaagat gaaggatacc 240

gactctgagg aggagctcaa agaggcattc agagtttttg acaaggatca gaatggtttc 300

atctctgcgg ccgagctccg tcatgtgatg actaatctcg gtgagaagct tactgatgaa 360

gaggtcgatg agatgatcag agaagctgat gtggatggtg atggccagat aaattatgag 420

gaatttgtca aggttatgat ggctaagtga 450

<210> 4

<211> 149

<212> PRT

<213> 人工序列(蛋白序列PdCaM247)

<400> 4

Met Ala Asp Gln Leu Thr Asp Asp Gln Ile Ser Glu Phe Lys Glu Ala

1 5 10 15

Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Cys Ile Thr Thr Lys Glu

20 25 30

Leu Gly Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu

35 40 45

Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile

50 55 60

Asp Phe Pro Glu Phe Leu Asn Leu Met Ala Arg Lys Met Lys Asp Thr

65 70 75 80

Asp Ser Glu Glu Glu Leu Lys Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp

85 90 95

Gln Asn Gly Phe Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn

100 105 110

Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu

115 120 125

Ala Asp Val Asp Gly Asp Gly Gln Ile Asn Tyr Glu Glu Phe Val Lys

130 135 140

Val Met Met Ala Lys

145

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增引物PdCaM247-RT-F)

<400> 5

tcaattgacg gatgaccaga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(扩增引物PdCaM247-RT-R)

<400> 6

catcttcctt gccatgaggt 20

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(启动子正向引物ProPdCaM247-F)

<400> 7

ggggacaact ttgtacaaaa aagttggatg accacaacct ccgttcaa 48

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(启动子反向引物ProPdCaM247-R)

<400> 8

ggcggccgca caactttgta caagaaagtt gggtacctag aaggagataa aaacctgaga 60