MTCH2在制备与铁死亡相关的癌症治疗药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种MTCH2在制备与铁死亡相关的癌症治疗药物中的应用。

背景技术

线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，是一种非特异性通道，其分子组成尚未完全清楚，多数学者认为其是由外膜的电压依赖的阴离子通道(VDAC)、内膜的腺嘌呤核苷转位蛋白(ANT)以及亲环素D等组成。线粒体通透性转变是Ca

mPTP开放的现象在线粒体内膜体中无法被检测到，提示mPTP的开放需要线粒体外膜的存在，但是线粒体外膜蛋白在mPTP开放中的作用和分子机制还不清楚。线粒体载体同源物2(MTCH2)不同于其他线粒体载体蛋白家族，主要定位于线粒体外膜上。最新研究发现MTCH2是线粒体外膜蛋白插入酶，可以协助促凋亡因子嵌入线粒体外膜，有望成为癌症治疗的新方向。MTCH2招募tBID到线粒体，tBID激活Bax/Bak，导致线粒体外膜通透性转变，细胞色素C释放，促进细胞凋亡。mPTP能够引起外膜的通透性增加和破裂，然而，外膜蛋白是否影响线粒体内膜的通透性转变和作用机制仍未被研究，MTCH2是否参与调控mPTP开放还不清楚。

铁死亡是一种铁依赖的新型的调节性细胞死亡方式，在形态学、生物化学和遗传学上区别于凋亡、坏死和自噬。在形态学方面，线粒体变小、皱缩、内嵴减少或消失、外膜破裂。铁死亡的特征为铁依赖的脂质过氧化物累积，细胞膜上的多不饱和脂肪酸(PUFA)发生脂质过氧化，诱导细胞死亡。

癌症是对人类健康最具威胁的重大疾病之一，而调节性细胞死亡过程的发现使癌症治疗取得了很大进展。近年来，铁死亡吸引了很多癌症研究人员的广泛关注，探索靶向铁死亡治疗癌症的方法策略。胰腺癌是致死率最高的癌症之一，易产生对细胞凋亡的抗性，化疗和放疗的效果较差，目前相应的有效治疗方法非常有限。铁死亡是一种非凋亡性细胞死亡，有望为胰腺癌提供新的治疗策略。胰腺导管腺癌(PDAC)是胰腺癌的主要类型，具有基因突变率高、预后差等特点，超过90％的PDAC患者拥有KRAS基因突变，导致过量的副产物活性氧(ROS)生成，抑制ROS的解毒途径比如胱氨酸饥饿能够诱导铁死亡杀死癌细胞。线粒体在细胞氧化还原稳态的调控中扮演着重要角色，同时mPTP参与细胞内ROS稳态的调控，靶向线粒体mPTP有望通过诱发肿瘤细胞发生铁死亡治疗癌症。但是目前mPTP促进肿瘤细胞铁死亡的调控因子和作用机制尚不明确。聚焦探索mPTP的调控因子和作用机制，有利于为靶向mPTP促进肿瘤铁死亡治疗胰腺癌提供新靶点和新策略。

发明内容

基于目前mPTP促进肿瘤细胞铁死亡的调控因子和作用机制尚不明确的现状，本发明提供MTCH2在制备与铁死亡相关的癌症治疗药物中的应用。

本申请聚焦探索新的mPTP调控因子和作用机制，为靶向mPTP促进肿瘤铁死亡治疗胰腺癌提供新靶点和新策略。

本发明以mPTP的经典调控蛋白CyPD为线索，通过质谱分析CyPD的免疫共沉淀物，找到主要定位于线粒体外膜的MTCH2蛋白，继而围绕MTCH2对mPTP的调控作用和分子机制展开一系列研究，同时检测mPTP的开放活性是否参与调控铁死亡，揭示了MTCH2可能通过mPTP调控铁死亡，为靶向线粒体治疗癌症提供了新的理论依据。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供MTCH2在制备与铁死亡相关的癌症治疗药物中的应用。

在本发明的一个实施方式中，提供靶向MTCH2的物质在制备调控mPTP诱发肿瘤细胞发生铁死亡治疗癌症的药物中的应用。

在本发明的一个实施方式中，提供MTCH2基因的特异性敲降试剂在制备与铁死亡相关的癌症治疗药物中的应用，其中，MTCH2基因的核苷酸序列为：ACCGGTGCTCATCCAGGTGGGATATGACTCGAGTCATATCCCACCTGGATGAG CTTTTTGAATTC。

在本发明的一个实施方式中，提供MTCH2基因的特异性敲降试剂在制备抑制mPTP的开放诱发肿瘤细胞发生铁死亡治疗癌症的药物中的应用。

在本发明的一个实施方式中，提供MTCH2基因的特异性敲降试剂在制备抑制mPTP的开放诱发肿瘤细胞发生铁死亡治疗癌症的药物中的应用。本发明研究发现，MTCH2通过mPTP调控铁死亡，进而实现靶向铁死亡治疗癌症。具体而言，本发明发现，MTCH2参与调控mPTP的开放。敲降MTCH2能显著降低mPTP对Ca

在本发明的一个实施方式中，提供F-ATP合成酶的j亚基基因的特异性敲降试剂在制备抑制mPTP的开放诱发肿瘤细胞发生铁死亡治疗癌症的药物中的应用。本发明研究发现，F-ATP合成酶的j亚基和MTCH2存在相互作用，敲降j亚基能显著降低mPTP对Ca

在本发明的一个实施方式中，提供阻断MTCH2与F-ATP合成酶的j亚基的相互作用的药剂在制备抑制mPTP的开放诱发肿瘤细胞发生铁死亡治疗癌症的药物中的应用。

在本发明的一个实施方式中，提供MTCH2在制备结合CyPD并促进F-ATP合成酶二聚化，参与调控mPTP，抵御铁死亡的药物中的应用。

在本发明的一个实施方式中，所述癌症为胰腺癌。

在本发明的一个实施方式中，所述胰腺癌为胰腺导管腺癌。

本发明利用慢病毒shRNA干扰技术敲降MTCH2。通过线粒体钙离子滞留能力(CRC)检测敲降MTCH2和过表达MTCH2是否影响mPTP开放对Ca

本发明还构建表达MTCH2和CyPD的质粒，并通过外源免疫共沉淀(IP)分析MTCH2和CyPD的相互作用。通过非变性凝胶电泳(Native-PAGE)实验和胶内F-ATP合成酶活性染色方法分析MTCH2敲降对F-ATP合成酶二聚体形成的影响，并观察重新表达MTCH2或者过表达CyPD对F-ATP合成酶二聚体形成的影响。

通过HuRI(人类蛋白互作组数据库)分析与MTCH2存在相互作用的蛋白，结果显示MTCH2能够和F-ATP合成酶j亚基相互作用。通过外源IP验证MTCH2和j亚基的相互作用。利用慢病毒shRNA干扰技术敲降j亚基，通过CRC实验检测j亚基敲降对mPTP开放的影响。

基于以上研究内容，进一步通过内源IP实验确定MTCH2和CyPD以及j亚基的相互作用，使用GST-pulldown实验分析蛋白质相互作用直接或间接关系；IP实验观察叔丁基过氧化氢处理是否影响MTCH2、CyPD和j亚基之间的相互作用；通过分离亚线粒体结构并结合免疫印迹实验，鉴定CyPD在线粒体外膜、膜间隙、线粒体内膜体的定位，分析CyPD是否能够定位于外膜并结合外膜蛋白；CRC实验检测单独或者联合过表达MTCH2、CyPD、j亚基对mPTP开放活性的影响；在CyPD和j亚基敲降的变异体中过表达MTCH2后，通过CRC实验分析CyPD和j亚基对MTCH2激活mPTP的必要性；Native-PAGE实验观察j亚基敲降对酶二聚化的影响；透射电镜观察MTCH2、CyPD或j亚基敲降后，以及在MTCH2敲降的变异体中重新表达MTCH2或过表达CyPD后，线粒体的形态学变化；Seahorse XF-24检测敲降MTCH2、CyPD或j亚基是否影响细胞耗氧率(OCR)。

通过细胞活力检测敲降MTCH2、CyPD或j亚基对铁死亡诱导剂RSL3的敏感度的影响，并观察抗氧化剂TEMPO和靶向线粒体的抗氧化剂MitoTEMPO处理对细胞活力的影响。

将RSL3处理后的细胞进行MitoPeDPP染色、MitoSOX染色，然后通过流式分析检测线粒体的脂质过氧化情况、线粒体内ROS累积情况；Seahorse XF-24检测在NC、MTCH2、CyPD或j亚基敲降的变异体中，RSL3处理是否影响细胞耗氧率(OCR)；CRC实验检测不同细胞系对RSL3诱导的铁死亡的敏感度的差异与mPTP活性的关系；免疫印迹实验检测RSL3处理后细胞内Cleaved Caspase-3的表达水平，验证是否存在细胞凋亡。

通过细胞活力检测，在胰腺癌细胞系MIA PaCa-2中，敲降MTCH2、CyPD或j亚基对RSL3敏感度的影响。

为进一步评估mPTP调控铁死亡在临床上的潜在应用价值，将构建NC、MTCH2、CyPD或j亚基敲降变异体的MIA PaCa-2胰腺癌细胞异种移植的小鼠肿瘤模型，腹腔注射铁死亡诱导剂后定时测量肿瘤大小。

与现有技术相比，本发明的优点及有益效果如下：

本发明研究发现了线粒体外膜蛋白MTCH2对线粒体内膜的mPTP的调控作用和分子机制，为线粒体内外膜上蛋白协作共同调控线粒体通透性转变的发生提供了新的理论依据。铁死亡是抗肿瘤的一个重要机制，本发明的公开将为铁死亡的调控提供新的分子机制，为靶向mPTP通过铁死亡治疗癌症提供了实验数据的支持，具有重要的研究意义和潜在的临床价值。

附图说明

图1：本发明的研究技术路线图。

图2：MTCH2参与调控mPTP的开放。(A-B)qPCR检测MTCH2(A)和PPIF(B)在HEK293T细胞系中的敲降效率；(C-D)Digitonin通透化野生型对照组(shNC)、敲降MTCH2(shMTCH2)、敲降CyPD(shPPIF)的HEK293T细胞系后检测线粒体的钙滞留能力，线粒体摄入和释放Ca

图3：MTCH2结合F-ATP合成酶的j亚基调控酶二聚体的形成和mPTP的开放。(A-B)shNC、shMTCH2的HEK293T细胞中转染MTCH2和PPIF质粒使其分别过表达MTCH2和CyPD；Western blot鉴定过表达情况(A)；Digitonin提取线粒体蛋白进行Native-PAGE和胶内F-ATP合成酶水解活性染色，分析F-ATP合成酶二聚体的形成情况(B)；(C)基于HuRI分析MTCH2可能存在相互作用的蛋白；C14orf2为编码j亚基的ATP5MJ基因的别名；(D)在HEK293T细胞中通过外源表达ATP5MJ质粒和免疫共沉淀实验分析j亚基和MTCH2的相互作用；(E)Westernblot鉴定j亚基的敲降效率；(F-G)Digitonin通透化shNC和shATP5MJ的HEK293T细胞系后检测线粒体的钙滞留能力，线粒体摄入和释放Ca

图4：mPTP功能失调促进胰腺癌细胞铁死亡。(A)在shNC、shMTCH2、shATP5MJ或shPPIF的MIA PaCa-2细胞系中，通过细胞活性实验，检测细胞对RSL3诱导的铁死亡敏感性；(B-E)在shNC(B)、shPPIF(CB)、shMTCH2(D)或shATP5MJ(E)的MIA PaCa-2细胞系中，RSL3处理诱导细胞发生铁死亡，通过细胞活性实验，观察Lip-1、TEMPO或MitoTEMPO预处理对RSL3诱导的铁死亡的影响。

图5：MTCH2结合CyPD并促进F-ATP合成酶二聚化，参与调控mPTP，抵御铁死亡的机理图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

探索新的mPTP调控因子的实施方案

(1)构建表达CyPD的质粒：将编码CyPD的PPIF基因的cDNA(采用普通的cDNA质粒构建技术即可获得)通过XhoI和EcoRI酶切位点连接到pcDNA3.1+/C-HA载体上，氨苄青霉素筛选单克隆，测序验证目的基因正确嵌入载体。

(2)质粒转染：将生长状态良好的HEK293T野生型细胞或者MIA PaCa-2的ΔPPIF变异细胞株铺板，第二天细胞生长至60％左右时用PEI转染法将PPIF-HA质粒转染至细胞，待24h后收集细胞。

其中，MIAPaCa-2的ΔPPIF变异细胞株可以通过常规的LentiCRISPR方法获得，中，sgRNA序列为：上游引物：5'-CACCGCGGGAACCCGCTCGTGTACC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；下游引物：3'-AAACGGTACACGAGCGGGTTCCCGC-5’(如SEQ ID NO.2所示)。

(3)免疫共沉淀和质谱分析：从收集的细胞中提纯线粒体，然后用温和去污剂digitonin提取线粒体蛋白，加入适量的HA beads，4度旋转孵育过夜，洗去非特异性结合蛋白，将beads进行蛋白相互作用交联质谱检测。

研究MTCH2调控mPTP活性的实施方案

(1)构建shRNA质粒：通过Invitrogen Block-iT RNAi Designer网站设计靶向MTCH2和PPIF基因的序列(MTCH2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：ACCGGTGCTCATCCAGGTGGGATATGACTCGAGTCATATCCCACCTGGATGAG CTTTTTGAATTC；PPIF基因的核苷酸序列如SEQID NO.4所示：ACCGGTGGAGGACATCCAAGAAGATTGCTCGAGCAATCTTCTTGGATGTCCTCCTTTTTGAATTC)，将该序列通过AgeI和EcoRI酶切位点克隆至载体PLKO.1-PURO上，氨苄青霉素筛选单克隆，测序验证目的片段正确嵌入载体。

(2)慢病毒shRNA干扰技术敲降MTCH2：将包装好的新鲜病毒和细胞悬浮液混合，加入聚凝胺(终浓度为8μg/ml)后孵育培养24h，更换新鲜的完全培养基继续培养24h，嘌呤霉素筛选被病毒成功感染的细胞。收集部分细胞并提取RNA后进行逆转录，根据SYBR Green的操作说明准备qPCR反应混合物，分析敲降效率。

(3)人细胞通透化和线粒体钙离子滞留能力：利用digitonin将人培养细胞通透化。Calcium green-5N作为检测液中Ca

(4)人细胞线粒体提纯和溶胀实验：将收集的细胞用PBS洗一遍后，悬浮于线粒体提纯缓冲液，动作温柔地匀浆十余次，然后进行梯度离心获得提纯的线粒体。BCA定量后，将线粒体悬浮于检测缓冲液中，加入一个剂量的Ca

(5)Calcein/Co

(6)TMRM染色：利用阳离子亲脂性红色荧光染料TMRM检测线粒体膜电位，正常情况下TMRM会累积于线粒体基质中，使线粒体在镜下发出较强的红色荧光，mPTP开放导致线粒体膜电位丧失，TMRM弥散在胞浆内，荧光强度会明显减弱。将培养的细胞经过叔丁基过氧化氢预处理数小时来诱导mPTP开放，然后同TMRM共孵育20min，于激光共聚焦下观察荧光强度并拍照。

研究MTCH2调控mPTP的分子机制的实施方案

(1)Native-PAGE：在shNC和shMTCH2的HEK293T细胞中过表达MTCH2或CyPD，提纯线粒体，然后用digitonin提取线粒体蛋白，通过Native-PAGE分离不同分子质量的蛋白复合物，利用F-ATP合成酶水解ATP的能力进行胶内酶活性染色。

(2)免疫共沉淀：外源IP：构建表达MTCH2的质粒，转染HEK293T细胞，CoIP裂解液提取蛋白，加入适量HA beads(一个样品加8-10微升)，4度旋转孵育过夜，洗去非特异性结合蛋白，通过Western blot检测MTCH2、CyPD和j亚基等蛋白。内源IP：CoIP裂解液提取HEK293T细胞的蛋白，加入10μl Protein A/G Plus Agarose Beads和相应蛋白的一抗，4度旋转孵育过夜，洗去非特异性结合蛋白，通过Western blot检测MTCH2、CyPD和j亚基等蛋白。

(3)分离亚线粒体结构：通过梯度离心法从HEK293T细胞中提纯线粒体；利用线粒体内外膜对digitonin敏感度的差异，将线粒体与digitonin(digitonin：线粒体蛋白为1.5g/g)孵育并涡旋15分钟后离心，上清为溶解的线粒体外膜和膜间隙蛋白，沉淀为线粒体内膜体；通过Western blot鉴定CyPD在线粒体外膜、膜间隙、线粒体内膜体的分布；分析CyPD除了线粒体基质内的定位外，是否也能够定位于线粒体外膜并结合外膜蛋白。

(4)人类蛋白互作组数据库分析：通过HuRI(人类蛋白互作组数据库)分析，查找与MTCH2相互作用的候选蛋白，重点关注F-ATP合成酶的亚基，分析MTCH2在调控mPTP和F-ATP合成酶二聚化中的作用和潜在机制。

(5)线粒体钙离子滞留能力：利用慢病毒shRNA干扰技术敲降j亚基，在CyPD和j亚基敲降的变异体中过表达MTCH2，用digitonin将人培养细胞通透化，Calcium green-5N作为Ca

(6)GST-pulldown实验：进一步鉴定MTCH2、CyPD和j亚基之间相互作用的直接或间接关系。纯化原核表达的GST-MTCH2以及HIS标签的CyPD和j亚基，与GST beads共孵育后，洗去非特异性结合蛋白，谷胱甘肽洗脱MTCH2，通过Western blot并使用HIS标签的抗体检测与MTCH2特异结合的蛋白质。

(7)透射电镜观察线粒体形态：在shMTCH2的HEK293T细胞中过表达MTCH2或CyPD或转染空载，shNC转染空载作为阳性对照，24h后用电镜固定液收集细胞于EP管中，离心后去上清，缓缓加入1.5ml新的电镜固定液，置于4度固定过夜，包埋制片，于透射电镜下观察线粒体形态并拍照。

(8)Seahorse XF-24：将细胞铺于XF24微孔细胞板中，第二天将细胞培养液吸掉，每孔加入0.5ml Seahorse XF检测液，置于无CO

研究MTCH2通过mPTP调控铁死亡的实施方案

(1)细胞活性检测：将shNC、shMTCH2、shPPIF和shATP5MPL的HEK293T细胞均匀铺于96孔板中，第二天加入不同剂量的RSL3，处理8h后，利用CellTiter-Glo Luminescent CellViability Assay(Promega)试剂盒检测细胞活性。为了观察脂质氧化和ROS对铁死亡的影响，在细胞悬液中加入10μM Lip-1、TEMPO、MitoTEMPO或溶剂DMSO后铺于96孔板中，孵育约20h后加RSL3处理。

(2)线粒体脂质过氧化和ROS的检测：将shNC、shMTCH2、shPPIF和shATP5MPL的HEK293T细胞悬浮稀释至一定密度，加入10μM Lip-1、TEMPO、MitoTEMPO后铺于48孔板中，第二天进行RSL3处理后，MitoPeDPP染色30min或MitoSOX染色10min，HBSS洗去多余的染料，胰酶消化后用HBSS收集细胞于96孔板中，Guava easyCyte流式分析。

(3)Seahorse XF-24：将shNC、shMTCH2、shPPIF和shATP5MPL的HEK293T细胞铺于XF24微孔细胞板中，细胞种植密度同细胞活性检测。第二天用Agilent Seahorse XFe24细胞能量代谢分析仪检测耗氧率(OCR)，依次加入RSL3(检测3h)、oligomycin、FCCP、rotenone/antimycin A，分析RSL3处理对线粒体氧化呼吸的影响。

(4)线粒体钙离子滞留能力：用digitonin将不同细胞系通透化，检测液中定时定量加入Ca

研究MTCH2通过mPTP调控铁死亡在胰腺癌治疗中的潜在应用价值的实施方案

(1)MTCH2参与调控mPTP：构建shNC、shMTCH2、shPPIF和shATP5MPL的MIA PaCa-2细胞系，通过CRC实验、线粒体溶胀实验和Calcein/Co

(2)细胞活性检测：利用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega)试剂盒检测敲降MTCH2、CyPD或j亚基对RSL3诱导的铁死亡的调控作用，并观察Lip-1、TEMPO、MitoTEMPO预处理对铁死亡的影响。

(3)裸鼠成瘤：将shNC、shMTCH2、shPPIF和shATP5MPL的MIAPaCa-2细胞悬液皮下注射到4-6周龄的裸鼠，当肿瘤长至50-100mm

图1使出了本发明的研究技术路线图。

图2展示了MTCH2参与调控mPTP的开放。(A-B)qPCR检测MTCH2(A)和PPIF(B)在HEK293T细胞系中的敲降效率；(C-D)Digitonin通透化shNC、shMTCH2、shPPIF的HEK293T细胞系后检测线粒体的钙滞留能力，线粒体摄入和释放Ca

从图2可以看出，MTCH2参与调控mPTP的开放。通过CyPD的免疫共沉淀物的质谱分析发现，MTCH2能够结合CyPD。文献报道MTCH2招募tBID激活Bax/Bak，从而诱导线粒体外膜通透性转变，但是MTCH2是否参与调控mPTP开放还不清楚。本申请中，利用慢病毒shRNA干扰技术构建了shMTCH2(图2A)和shPPIF(图2B)的HEK293T稳定细胞系；CRC实验结果显示敲降MTCH2能显著降低mPTP对Ca

图3展示了MTCH2结合F-ATP合成酶的j亚基调控酶二聚体的形成和mPTP的开放。(A-B)shNC、shMTCH2的HEK293T细胞中转染MTCH2和PPIF质粒使其分别过表达MTCH2和CyPD；Western blot鉴定过表达情况(A)；Digitonin提取线粒体蛋白进行Native-PAGE和胶内F-ATP合成酶水解活性染色，分析F-ATP合成酶二聚体的形成情况(B)；(C)基于HuRI分析MTCH2可能存在相互作用的蛋白；C14orf2为编码j亚基的ATP5MJ基因的别名；(D)在HEK293T细胞中通过外源表达ATP5MJ质粒和免疫共沉淀实验分析j亚基和MTCH2的相互作用；(E)Westernblot鉴定j亚基的敲降效率；(F-G)Digitonin通透化shNC和shATP5MJ的HEK293T细胞系后检测线粒体的钙滞留能力，线粒体摄入和释放Ca

在shNC和shMTCH2的HEK293T细胞中，分别过表达空载体、MTCH2、CyPD(图3A)，提纯线粒体并用digitonin提取线粒体蛋白，进行Native-PAGE和胶内F-ATP合成酶水解活性染色，结果显示shMTCH2线粒体中F-ATP合成酶的二聚体的形成受到明显抑制，而重新表达MTCH2或者过表达CyPD能够恢复酶的二聚化状态(图2B)，提示CyPD可能促进MTCH2参与F-ATP合成酶二聚体的形成。

通过HuRI分析，本申请中，发现MTCH2可能会与F-ATP合成酶的j亚基相互作用(图3C)。在HEK293T细胞外源过表达j亚基后进行免疫共沉淀分析，结果表明j亚基和MTCH2存在相互作用(图3D)。如果MTCH2是通过与j亚基相互作用调控mPTP的，那么j亚基可能直接参与mPTP的调控和构成；为了鉴定j亚基对mPTP开放的影响，本申请中，构建了shATP5MJ的HEK293T稳定细胞系(图3E)；CRC实验结果显示敲降j亚基能显著降低mPTP对Ca

图4显示了mPTP功能失调促进胰腺癌细胞铁死亡。(A)在shNC、shMTCH2、shATP5MJ或shPPIF的MIAPaCa-2细胞系中，通过细胞活性实验，检测细胞对RSL3诱导的铁死亡敏感性；(B-E)在shNC(B)、shPPIF(CB)、shMTCH2(D)或shATP5MJ(E)的MIA PaCa-2细胞系中，RSL3处理诱导细胞发生铁死亡，通过细胞活性实验，观察Lip-1、TEMPO或MitoTEMPO预处理对RSL3诱导的铁死亡的影响。

Badgley MA等发现缺乏半胱氨酸或者IKE处理能促进胰腺癌细胞死亡，然而，在五种不同的胰腺导管腺癌细胞系中，除了MIAPaCa-2细胞系，其他四种胰腺癌细胞系均对缺乏半胱氨酸或者IKE处理具有高度敏感性。本申请为了探究mPTP在MIAPaCa-2细胞抵抗缺乏半胱氨酸或者IKE诱导的铁死亡中的功能，构建了shMTCH2、shATP5MJ或shPPIF的MIAPaCa-2变异细胞系。本申请中，发现，敲降MTCH2、CyPD或j亚基均能显著增强细胞对RSL3的敏感度(图4A)，表明抑制mPTP的活性能够促进RSL3诱导的MIA PaCa-2细胞铁死亡。因此，申请人推测：相较于其他四种胰腺癌细胞系，MIA PaCa-2细胞可能具有较强的mPTP生理活性，有助于避免线粒体脂质过氧化物累积，从而逃逸铁死亡。

在shNC的MIA PaCa-2细胞系中，Lip-1、TEMPO或MitoTEMPO均能够基本完全阻止RSL3诱导的铁死亡(图4B)；在shPPIF(图4C)、shMTCH2(图4D)或shATP5MJ(图4E)的MIAPaCa-2变异细胞系中，Lip-1基本能完全阻止RSL3诱导的铁死亡，而TEMPO或MitoTEMPO虽然均能显著抑制RSL3诱导的铁死亡，但是MitoTEMPO的抑制作用的显著性更高。基于此，申请人推测：正常细胞具有生理活性的mPTP，线粒体基质内的ROS可能通过短暂性开放的mPTP释放到胞质中，从而避免线粒体脂质过氧化物累积致的铁死亡；而当mPTP的活性受损后，ROS容易在线粒体基质内聚集，导致线粒体脂质过氧化物累积，进而促进铁死亡的发生。这一发现为MTCH2通过mPTP调控铁死亡在胰腺癌治疗中作用的研究打下良好基础。

图5揭示了MTCH2结合CyPD并促进F-ATP合成酶二聚化，参与调控mPTP，抵御铁死亡的机理。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。