一种法夫驹形氏酵母无细胞蛋白表达系统

技术领域

本发明属于生物合成技术领域，尤其涉及一种法夫驹形氏酵母无细胞蛋白表达系统。

背景技术

法夫驹形氏酵母是一种著名的表达重组蛋白质的甲基营养型酵母，具有表达量高、易培养等优点。因此，利用法夫驹形式酵母表达重组蛋白越来越受到重视，目前已有超过5000种重组蛋白成功以法夫驹形氏酵母表达，其中70余种重组蛋白已上市。近年来法夫驹形氏酵母已经利用多基因的共同表达生产高附加值化合物。但是，构建重组法夫驹形氏酵母的步骤比较复杂，甲醇诱导时间长，因此需要构建法夫驹形氏酵母的快速表达系统，用于初步筛选重组蛋白质，用于重组法夫驹形氏酵母的应用。

无细胞蛋白质表达系统(Cell-freeproteinexpressionsystem,CFPS)为体外模拟细胞表达蛋白质的体系，可以进行基因转录、翻译，最终表达目的蛋白质。它与传统的细胞蛋白质表达系统相比，具有反应快速、操作高通量、控制精准、系统稳定的特点，因而备受研究者的青睐。随着对外源蛋白复杂程度和产量需求的不断提高，高活性CFPS的构建研究受到了越来越多的关注。

目前法夫驹形氏酵母的CFPS均采用在质粒模板中利用T7启动子，该启动子需要用IPTG诱导细胞自身合成T7RNA聚合酶制备细胞裂解液或在CFPS体系中添加外源T7RNA聚合酶。这使得CFPS系统操作较复杂且增加CFPS成本。另外，细胞裂解液占总反应体系体积的20％～50％，是无细胞系统中重组蛋白表达的关键成分。目前，细胞裂解液的制备过程包括细胞培养、细胞搜集洗涤、细胞裂解、裂解液透析和裂解液后处理步骤。目前仍不能有效地控制细胞裂解液的性能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种法夫驹形氏酵母无细胞蛋白表达系统，其特征在于，包括如下步骤：

S1：制备高活性的法夫驹形氏酵母细胞裂解液；

S2：构建质粒模板；

S3：将高活性的法夫驹形氏酵母细胞裂解液与质粒模板混合，得到法夫驹形氏酵母CFPS；

S4：对法夫驹形氏酵母CFPS表达eGFP进行检测，得到检测结果。

进一步地，S1中，制备高活性的法夫驹形氏酵母细胞裂解液包括如下步骤：

S11：培养并收集法夫驹形氏酵母细胞；

S12：并对收集到的法夫驹形氏酵母细胞进行破碎处理，得到裂解液；

S13：对法夫驹形氏酵母细胞破碎后得到的裂解液进行预处理；

S14：透析预处理后的法夫驹形氏酵母细胞的裂解液；

S15：对透析后的法夫驹形氏酵母细胞的裂解液进行后处理，得到高活性的法夫驹形氏酵母细胞裂解液。

进一步地，S11具体包括如下步骤：

S111：从静态法夫驹形式酵母YPD培养基平板上挑取单菌落于液体培养基三角瓶内进行过夜培养，得到种子液；

S112：将种子液转接到多个液体培养基的三角瓶内培养，并皆添加甲醇诱导，培养完成后的多瓶种子液通过离心法离心，离心后的多瓶培养物去除上清液得到多份法夫驹形氏酵母细胞；

S12中，裂解液的制备包括如下步骤：

S121：将多个S112中得到的多份法夫驹形氏酵母细胞分别置于多个盛放有预冷的冷解液的离心杯中重悬，多个离心杯进行离心和去除上清液，然后对多个离心杯内物质重复洗涤，得到多份湿菌体；

S122：将多份湿菌体分别放置于多个预先盛放有预冷的冷解液和酸洗玻璃珠的2mL离心管内，多个2mL离心管进行涡旋和冰浴的多次循环处理；

S123：合并所有2mL离心管内的液体至第一离心管内，并进行离心操作；

S124：取出S123离心后的上清液至第二离心管内，对第二离心管进行离心操作，取出离心后的上清液，此上清液为裂解液；

S13中，对裂解液添加预处理液，并将添加后的液体置于摇床内进行预处理；

S14中，将预处理后的裂解液置于透析袋中完成透析；

S15中，将预处理并完成透析的裂解液置于冷冻离心机内离心，收集离心后的上清液，得到高活性的法夫驹形氏酵母细胞裂解液。

进一步地，S112中，培养细胞时，种子液的接种量为三角瓶内液体总量的1％～4％，诱导时，甲醇的添加量为三角瓶内液体总量的1％～4％；

S122中，酸洗玻璃珠和湿菌体的质量比为1：1～2：1，涡旋和冰浴的多次循环处理具体为：每个循环中，涡旋时间和水浴时间皆为30～60s，循环次数为30～60次。

进一步地，S2中，质粒模板的构建具体包括如下步骤：

S21：在载体质粒pET25b上敲除P

S22：将P

进一步地，S21中，IRES序列为蟋蟀麻痹病毒(Cricketparalysisvirus,CrPV)序列，poly(A)序列的长度为30～150bp。

进一步地，S3中，法夫驹形氏酵母CFPS的组分还包括：HEPES-KOH、谷氨酸钾、谷氨酸镁、NTP(由ATP，CTP，GTP和UTP组成)、肌酸磷酸、DTT、腐胺、亚精胺和肌酸磷酸激酶，通过将HEPES-KOH、谷氨酸钾、谷氨酸镁、NTP、肌酸磷酸、DTT、腐胺、亚精胺和肌酸磷酸激酶与高活性的法夫驹形氏酵母细胞裂解液以及质粒模板进行混合，并在1.5mL离心管中反应，反应后得到法夫驹形氏酵母CFPS。

进一步地，HEPES-KOH的pH值为7.4，浓度为25mmol/L；谷氨酸钾的浓度为70-150mmol/L；谷氨酸镁的浓度为4-8mmol/L；NTP的浓度皆为0.7-1.5mmol/L；肌酸磷酸的浓度为15-35mmol/L；DTT的浓度为1.7mmol/L；腐胺的浓度为1mmol/L；亚精胺的浓度为0.5mmol/L；肌酸磷酸激酶取自兔肌肉，质量为0.27mg/mL；质粒模板的质量为16.7ug/mL，高活性的法夫驹形氏酵母细胞裂解液的体积为总反应体系的20％～50％。

进一步地，S4中，对法夫驹形氏酵母CFPS表达eGFP进行检测具体包括如下步骤：

S41：法夫驹形氏酵母CFPS反应2h后，每1h从反应体系中取2μLCFPS反应液置于一个1.5mL离心管中；

S42：对每个1.5mL离心管内CFPS反应液通过双蒸水进行稀释，稀释倍数为50倍；

S43：将稀释后的每个样品和对照品皆置于平底96孔板中，并使用多功能酶标仪完成eGFP的荧光检测。

进一步地，S43中，多功能酶标仪的激发波长和发射波长分别为488nm和510nm。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

1、本发明利用P

2、本发明的质粒模板更适合真核CFPS的表达。

3、本发明的高活性的法夫驹形氏酵母细胞裂解液的制备方法，利用P

附图说明

图1为本发明中质粒模板示意图；

图2为本发明中高活性的法夫驹形氏酵母细胞裂解液与普通赤酵母细胞裂解液制备操作对比示意图；

图3为本发明所述利用P

图4为本发明中P

图5为本发明中P

图6为单因素CFPS考察图

图7为多因素CFPS考察图。

具体实施方式

下面将结合示意图对本发明一种法夫驹形氏酵母无细胞蛋白表达系统进行更详细的描述，其中表示了本发明的优选实施例，应该理解本领域技术人员可以修改在此描述的本发明，而仍然实现本发明的有利效果，因此，下列描述应当被理解为对于本领域技术人员的广泛知道，而并不作为对本发明的限制。

一种法夫驹形氏酵母无细胞蛋白表达系统具体包括如下步骤：

步骤1：质粒模板的构建

构建质粒所需基因片段如表1所示：

表1

质粒模板的构建包括如下步骤：

步骤1.1：在载体质粒pET25b上敲除P

步骤1.2：将P

由于酵母CFPS平台仍然受到低表达产量的限制。在真核蛋白质表达平台中，翻译起始通常被认为是蛋白质合成中的限速步骤。用于成功改善真核CFPS反应平台中蛋白质合成的一种策略是利用内部核糖体进入位点(Internalribosome entrysite,IRES)，它们是翻译起始的强诱导剂。IRES可以通过与核糖体结合以不依赖于帽的方式启动翻译，所以它对联合转录和翻译(Tx/Tl)CFPS反应很有吸引力。

本发明研究测试了不同的IRES对真核CFPS的影响。

分别构建了不同P

本发明技术测试了IRES序列添加与否对真核CFPS的影响。

分别构建了P

KOZAK是位于真核生物mRNA5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是GCCACCAUGG，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始。对应于原核生物的SD序列。其是存在于真核生物mRNA的一段序列，在翻译的起始中有重要作用。有研究表明在真核生物中，起始密码子两端序列为：-G/C-G/C-G/C-ACCAUGG-，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG时，转录和翻译效率最高，常被应用于表达载体的构建中。

本发明技术测试了KOZAK序列添加与否对真核CFPS的影响。

分别构建了P

本发明技术测试了不同的poly(A)长度对真核CFPS的影响。

构建不同长度的poly(A)的P

本发明技术测试了poly(A)序列添加与否对真核CFPS的影响。

将P

步骤2：制备法夫驹形氏酵母高活性细胞裂解液

如图2所示，法夫驹形氏酵母高活性细胞裂解液的制备具体包括如下步骤：

步骤2.1：从新鲜SMD1163的YPD划线平板上挑取一个单菌落，于装有100mLYPD培养基的三角瓶中，30℃200rpm培养过夜做种子液；

步骤2.2：将过夜培养物以1％～4％接种量接种到4个装有200～250mL的BMGY培养基的1L三角瓶中，测量初始值OD600约为0.1(菌数为1×10^-8×10^-7)，30℃200rpm培养2～3d，每24h用1％～4％甲醇添加到培养基中诱导酵母RNA聚合酶II表达。连续培养3～5d后O600为16左右(菌数为1×10^-10～×10^-9)，以3000g和4℃，离心15min后去上清收集细胞；

步骤2.3：用提前4℃预冷的冷洗液清洗细胞。每个离心杯中加入50～100mL冷洗液，重悬，再以30000g4℃，离心10～15min去上清，重复洗涤2～3次；

步骤2.4：本实验采用震荡玻璃珠破碎细胞，在2mL离心管中加入0.5～1.5mL提前4℃预冷的冷解液、酸洗玻璃珠质量应为湿菌体质量的1～2倍，进行涡旋30～60s和冰浴30～60s的30～60个循环。

步骤2.5：合并所有2mL离心管中的液体到50mL第一离心管中，30000g4℃，离心15～30min；

步骤2.6：将上清液全部转移到第二离心管中，30000g4℃，再次离心15～30min后取出上清液；

步骤2.7：取出的上清液，加入等体积预处理液，放入摇床中以100rpm，30℃，震荡60～100min的条件预处理。

步骤2.8：处理后的裂解液利用3.5kDa透析袋在4℃下透析，加入50～100倍细胞裂解液体积的冷解液，4℃30～60min，透析3～4次。

步骤2.9：透析后的预处理液在冷冻离心机中4℃4000g10～30min，收集上清液备用。

本发明探究测试了种子液的不同接种量对SMD1163培养的影响。

培养了不同接种量的SMD1163菌株，通过持续监测OD600的数值发现大接种量可以快速高效地获得大量生长指数期的细胞。

高密度细胞可获得高浓度裂解液，有助于CFPS体系能量再生和蛋白质合成，蛋白质合成效率高。且对数期早期的细胞富含高活性酶，合成目的蛋白的能力比处于其他时期的细胞高。

本发明探究测试了不同浓度甲醇诱导SMD1163制备的细胞裂解液对真核CFPS的影响。

用不同浓度的甲醇诱导酵母RNA聚合酶II表达制备细胞裂解液。利用破碎后的裂解液分别构建真核CFPS系统表达eGFP，测试后发现低浓度的甲醇诱导制备裂解液的CFPS蛋白表达量最高。高浓度甲醇会对细胞产生毒性影响细胞生长。

本发明研究测试了不同的玻璃珠和湿菌质量比对真核CFPS的影响。

选取相同质量的玻璃珠加入不同质量的湿菌进行破碎。利用破碎后的裂解液分别构建真核CFPS系统表达eGFP，测试后发现小质量比的湿菌破碎制备裂解液的CFPS蛋白表达量最高。酵母细胞壁厚，选择小质量菌体破碎较充分，胞内有效物质释放充分。

本发明研究测试了不同的涡旋冰浴时间和涡旋次数对真核CFPS的影响。

选取不同破碎时间和破碎次数制备细胞裂解液。利用这些细胞裂解液分别构建同真核CFPS系统表达eGFP，测试后发现涡旋30～60s和冰浴30～60s的30～50个循环制备裂解液的CFPS蛋白表达量最高。涡旋时间次数少短细胞破碎不完全，涡旋时间长次数多裂解液中的有效成分可能会失活。

步骤3：利用P

如图3所示，在具体实施方案中，真核CFPS组分可包括但不限于：

在1.5mL离心管构建CFPS分别含有：pH7.4HEPES-KOH、谷氨酸钾、谷氨酸镁、NTP、20种氨基酸、肌酸磷酸、DTT，腐胺、

亚精胺、肌酸磷酸激酶(取自兔肌肉，Sigma-Aldrich，美国)、质粒、细胞裂解液混合。

该系统已经证明本设计构建的不依赖外源RNA聚合酶的真核CFPS系统可以有效地运行至少5h，这可以通过图4所示，P

真核CFPS组分可包括但不限于：

在1.5ml离心管中AOX1-SMD1163-CFPS分别含有：pH7.425mmol/LHEPES-KOH；30～180mmol/L谷氨酸钾；4～12mmol/L谷氨酸镁；NTP各0.1～1.5mmol/L；0.1mmol/L20种氨基酸；15～50mmol/L磷酸肌酸；1.7mmol/LDTT；1mmol/L腐胺；0.5mmol/L亚精胺；0.27mg/ml肌酸磷酸激酶(取自兔肌肉；Sigma-Aldrich，美国)；16.7ug/ml质粒以及占总反应体系20％～50％体积的细胞裂解液混合。

需注意除氨基酸可提前配置冻存-80℃外，其他组分均为现配。除特殊说明外，体系均在20～25℃反应3～7h。

步骤4：目的蛋白eGFP的检测

CFPS反应2h后，每1h从反应体系中取2μLCFPS反应液置于1.5mL离心管中，用双蒸水稀释50倍。稀释后的样品和对照品置于平底96孔板中。eGFP的荧光检测使用多功能酶标仪完成，激发和发射波长分别为488和510nm。

本实验中目的eGFP的荧光数值增加量计算如下：每个样品用多功能酶标仪运行测量4次，抛弃第一次运行数据(机器开启时第1次数据普遍不稳定)，用3次样品平均值减去3次阴性对照平均值，计算出各平行荧光数值读数。

计算公式为：

a.u.表示为计算所得荧光数值

a表示每次多功能酶标仪检测样品的数值

b表示每次荧光酶标仪检测阴性对照的数值

本发明研究测试了不同的激发和发射波长对真核CFPS表达eGFP检测的影响。由荧光数值变化最终敲定激发和发射波长分别为488和510nm。

该系统已经证明本设计构建的不依赖外源RNA聚合酶的高活性裂解液真核CFPS系统可以有效地运行至少5h，这可以通过图5.P

本发明研究测试了不同浓度的谷氨酸钾对真核CFPS的影响。

在已构建的真核CFPS中对谷氨酸钾组分进行了单因素探究。谷氨酸钾的浓度考察范围在30～180mmol/L。在真核CFPS中加入不同浓度的谷氨酸钾表达eGFP，在系统反应3h时测量荧光数值，并绘制曲线图，如图6a所示。结果表明谷氨酸钾的最优范围在70～150mmol/L。

本发明研究测试了不同浓度的谷氨酸镁对真核CFPS的影响。

在已构建的真核CFPS中对谷氨酸镁组分进行了单因素探究。谷氨酸镁的浓度考察范围在4～12mmol/L。在真核CFPS中加入不同浓度的谷氨酸钾表达eGFP，在系统反应3h时测量荧光数值，并绘制曲线图，如图6b所示。结果表明谷氨酸镁的最优范围在4～8mmol/L。

本发明研究测试了不同浓度的NTP对真核CFPS的影响。

在已构建的真核CFPS中对NTP组分进行了单因素探究。NTP的浓度考察范围在0.1～1.5mmol/L。在真核CFPS中加入不同浓度的谷氨酸钾表达eGFP，在系统反应3h时测量荧光数值，并绘制曲线图，如图6c所示。结果表明NTP的最优范围在0.7～1.5mmol/L。

本发明研究测试了不同浓度的磷酸肌酸对真核CFPS的影响。

在已构建的真核CFPS中对磷酸肌酸组分进行了单因素探究。磷酸肌酸的浓度考察范围在15～50mmol/L。在真核CFPS中加入不同浓度的磷酸肌酸表达eGFP，在系统反应3h时测量荧光数值，并绘制曲线图，如图6d所示。结果表明磷酸肌酸的最优范围在15～35mmol/L。

本发明研究根据上述四组分的最佳范围测试了不同浓度的四种组分组合对真核CFPS的影响。

在已构建的真核CFPS中对多因素：谷氨酸钾、谷氨酸镁、NTP和磷酸肌酸不同浓度影响进行了探究，每种组分的浓度选择详见表2。在真核CFPS中加入不同浓度的四种组分表达eGFP，在系统反应3h时测量荧光数值，并绘制柱状图，如图7.多因素CFPS考察图所示。

表2

根据表2的多组真核CFPS，由图7结果可知在氨酸钾、谷氨酸镁、NTP和磷酸肌酸的共同影响下本发明构建的真核CFPS均可以工作。可以明确谷氨酸钾的范围在70～150mmol/L，谷氨酸镁的范围在4～8mmol/L，NTP的范围在0.7～1.5mmol/L，磷酸肌酸的范围在15～35mmol/L时本发明构建的CFPS可以工作。

上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。