一种用于编码微球流道的大拐角连续U型流道及包含该流道的液滴生成器

技术领域

本实用新型涉及微流控制领域，具体而言，涉及一种用于生成多颗粒液滴的系统，尤其涉及一种用于编码微球流道的大拐角连续U型流道及包含该流道的液滴生成器。

背景技术

微流控芯片(Microfluidic Chip)，因为能够集成化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分选、裂解等基本操作单元，通过设计形态各异的流道，可以在微流控芯片上实现不同的功能，因而也被称作芯片实验室(Lab-on-a-Chip)，较于传统的实验室，微流控芯片具有试剂消耗量少、反应或者分析时间短等优点，减小昂贵试剂的消耗量可以控制成本。而时间的缩短则有利于缩减实验周期，结合平方厘米级别甚至平方毫米的芯片大小，在时间和空间上都大大减小了实验成本。微流控的应用领域有很多，在化学、生物学、医学等诸多领域都有着重要的应用。

利用微流控技术可控制得的微颗粒，不仅可以对微颗粒的尺寸、形状、单分散性、壳层厚度，以及微颗粒内部的结构、形状和组分等进行精确控制，还可以通过微颗粒结构和构成微颗粒的各功能组分的巧妙结合以赋予其更加多样化的功能，从而为新型微颗粒型功能材料的设计和研制提供新的思路和指导。

在生物领域中，液滴可以包裹细胞并作为生物反应器。细胞能被封装并培养成为组织或类器官。也可用于细胞分选，如分选精子和受精卵等细胞，来进行人工繁殖，包括人工授精，体外受精、克隆和胚胎分裂或卵裂。在生物化学领域，分散的液滴可被独立处理和操控。每个液滴都可作为一个独立的微反应器。

多颗粒液滴是指在生成的每一个液滴中包含了两种以上颗粒，其中包括细胞、编码微球(微球)等。为满足生化实验需求，现有技术中已有了实现多种颗粒液滴作为微量反应器的装置与方案。如Dropseq与10x(US10745742B2)所涉及到的双颗粒液滴微流控芯片。但这些现有装置和方案普遍存在编码微球流道容易堵塞的问题，从而造成有效通量低或有效液滴占比少等的不利结果。

因此急需找到一种结构简单，既能有效控制流阻又不易堵塞的编码微球流道，从而促进多颗粒液滴的有效生成。

实用新型内容

为解决上述问题，本实用新型提供一种用于编码微球流道的大拐角连续U型流道，通过控制连续U型流道的转弯处半径，保证大弯大拐，防止编码微球悬液中的微纤维在连续U型流道的转弯处堆积造成堵塞，并通过控制连续U型流道的长度，以及连接两个转弯处的直线流道的倾斜角度，有效控制流阻，从而实现多颗粒液滴的有效生成，提高有效液滴的占比，且结构简单，成本低。

本实用新型所述的多颗粒液滴，是指制备的每一颗液滴内部，包含了多种颗粒。在生化实验中，常常需要应用这种多颗粒液滴作为生物反应器，比如在单细胞测序时，需要利用一种双颗粒液滴，这种双颗粒液滴中同时包含有1个单细胞和1个带有引物的编码微球(微球)，从而能在液滴反应室内进行反应完成测序。

有效液滴，是指制备的多颗粒液滴中，正好含有每种颗粒各1颗。比如对于单细胞测序时用到的双颗粒液滴，其有效液滴是指每颗双颗粒液滴内部，必须正好含有1个单细胞和1颗编码微球。

制备单细胞单编码微球液滴时，需要将细胞悬液，编码微球悬液和油相通入微流控系统来生成液滴。其中的细胞悬液和油相都可以通过滤膜进行过滤，从而保证其中不含有灰尘、微纤维等杂质，使细胞悬液和油相在经过连续U型流道时不会出现堵塞现象，能够有效控制流阻从而控制流速。而编码微球悬液中的编码微球由于直径较大，一般有50μm左右，因此无法采用滤膜进行过滤，导致编码微球悬液会残存一些灰尘、微纤维等杂质。

连续U型流道可用于控制流道内液体的流速，并能排列颗粒，是指将颗粒悬浮液中的颗粒排列成单一流线，用于排列液相中的颗粒，提高有效的单液滴率，也称样本的聚焦，是细胞计数、检测和分离芯片等装置中的重要环节，直接影响了后续的检测和分选的精度与效率，在医学检测领域有重要的意义。但现有的连续U型流道都是由一段段规整的U型流道前后连接而成，其转弯处的转弯幅度较小，并不适用于编码微球悬液，在连续使用过程中，编码微球悬液中的灰尘、微纤维等杂质容易在连续U型流道的转弯处逐渐堆积，造成阻塞，严重影响液滴的制备效率和质量。

为解决现有技术中存在的问题，本实用新型提供了一种用于编码微球流道的大拐角连续U型流道，所述大拐角连续U型流道上包括弧形流道，该弧形流道包括一段或者多段半径不同的圆弧形流道，其中至少有一段圆弧形流道的半径为编码微球流道宽度的6倍以上。

本实用新型所述的大拐角，是指连接两条流道的转弯处流道的转弯幅度较大。该转弯处流道可以呈规整的圆弧形，也可以是由多段半径不同的圆弧形流道组成的弧形流道，但其中至少有一段圆弧形的半径必须为流道宽度的6倍以上。

本实用新型所述的编码微球悬液的连续U型流道的形状结构与传统的连续U型流道的形状结构有所区别，其转弯角处采用大幅度的拐角，连接该转弯处的上下两条流道可以是相互平行，也可以不相互平行。

在一些方式中，连接该转弯处的上下两条流道相互平行，但上下两条流道的间距由于大拐角的存在而变大。

还有一些方式中，连接该转弯处的上下两条流道不相互平行，两条流道向转弯处方向延伸的延长线交叉成锐角。

本实用新型通过为编码微球悬液设置大拐角的连续U型流道，使转弯处的半径控制在适当大的范围，当编码微球悬液在经过转弯半径更大的转弯处时，并通过控制流速，其中的灰尘、微纤维等杂质无法在转弯处堆积，从而解决了编码微球悬液经长时间运行易在转弯处的堵塞问题。

也就是说，在一定流速(0.01-0.1μL/s)时，编码微球在经过转弯半径更大的转弯处时，其中的灰尘、微纤维等杂质会在该流速下全部被冲走，而无法在转弯处形成堆积；但是在同样流速时，如果转弯半径较小，则编码微球悬液中的灰尘、微纤维等杂质很有可能会来不及被带走而逐渐沉积下来，随着灰尘、微纤维等杂质的沉积越来越多，流阻越来越大，流速越来越小，使沉积现象进一步加重，长时间运行就会造成堵塞。

大量研究证明，针对编码微球悬液的流速为(0.01-0.1μL/s)时，只需控制连续U型流道的转弯处半径为编码微球流道宽度的6倍以上时，编码微球悬液中的灰尘、微纤维等杂质无法在转弯处堆积，从而保证了编码微球流道的长时间畅通运行。

所有编码微球流道的宽度都是一致的，连续U型流道为编码微球流道的一部分，连续 U型流道的宽度与编码微球流道其他部分宽度也都是一致的。

进一步地，所述圆弧形流道的半径为流道宽度的6倍到20倍。

可以理解，连续U型流道的转弯处半径不能无限增大，还需考虑到整个微流控系统的布局，以及实现对流阻的适当控制，从而控制编码微球流速，保证有效液滴的生成。

进一步地，所述圆弧形流道的半径为流道宽度的10倍，与转弯处相连的两条直线流道的延长线成锐角交叉。

当转弯处的上下两条流道不相互平行时，也就是两条流道向转弯处方向延伸的延长线交叉成锐角时，编码微球悬液中的灰尘、微纤维等杂质更不容易在转弯处堵塞。

大量实验结果证明，当连续U型流道的转弯处半径为流道宽度的10倍时，既能保证编码微球悬液中的灰尘、微纤维等杂质无法在转弯处堆积，又能更好地控制流阻，从而帮助稳定编码微球流速，进一步提高有效液滴的生成效率。

进一步地，所述大拐角连续U型流道的弧形流道(转弯处)为一个或一个以上。

可以理解，连续U型流道的转弯处越多，越能有效控制流阻。

进一步地，所述大拐角连续U型流道的弧形流道为两个。

为了保证连续U型流道的大弯大拐，连续U型流道无法设置过多的转弯处，同时由于大角度的拐弯加上其他直线型流道，已可以顺利控制流阻，也不需要再设置过多转弯处，一般设置两个，左右各一个即可。

进一步地，连接两个弧形流道的直线流道水平或向上倾斜或向下倾斜布置。

连接两个转弯处的直线流道可以是水平的，也可以稍向上或向下倾斜，从而提高流阻，更有利于控制流速。本实用新型所述水平，是指将包含该连续U型流道的液滴生成器竖直摆放时，连接两个转弯处的直线流道与地面水平面平行，也就是与重心竖直向下方向垂直。所述向上，是指向流体的上游方向；所述向下，是指向流体的下游方向。

进一步地，连接两个弧形流道的直线流道向上倾斜布置。

进一步地，所述大拐角连续U型流道包括入口段直线流道和出口段直线流道，所述入口段直线流道与编码微球流道入口段夹角大于或等于90度。

在保证连续U型流道大弯大拐的同时，连续U型流道与其他直线流道的连接处也需保证大弯大拐，既能使编码微球悬液从其他直线流道顺利过渡到连续U型流道，以及从连续U 型流道顺利过渡到其他直线流道，又能防止编码微球悬液中的灰尘、微纤维等杂质的堵塞。

进一步地，所述大拐角连续U型流道的出口段直线流道与编码微球流道出口段夹角大于或等于90度。

可理解的是，当连接该转弯处的上下两条流道相互平行，则入口段直线流道与编码微球流道入口段夹角，或出口段直线流道与编码微球流道出口段夹角可以设置成90度，也可以设置成大于90度，从而保证大弯大拐；而当转弯处的上下两条流道不相互平行时，也就是两条流道向转弯处方向延伸的延长线交叉成锐角时，则入口段直线流道与编码微球流道入口段夹角，或出口段直线流道与编码微球流道出口段夹角优选大于90度。

进一步地，所述编码微球流道宽度为50-100μm，大拐角连续U型流道的转弯处半径为 500-1000μm。

进一步地，所述编码微球流道宽度为50μm，大拐角连续U型流道的转弯处半径为500 μm。

进一步地，所述大拐角连续U型流道的总长度为15000-25000μm；其中连接两个转弯处的直线流道向上倾斜，与水平线夹角为10～15度，长度为4000-6000μm；入口段直线流道长度为4000-6000μm，与编码微球流道入口段夹角为90-180度；出口段直线流道长度为4000-6000μm，与编码微球流道出口段夹角为90-180度。

进一步地，所述大拐角连续U型流道的总长度为20000μm；其中连接两个转弯处的直线流道向上倾斜，与水平线夹角为10～15度，长度为6240μm；入口段直线流道长度为5000μm，与编码微球流道入口段夹角为120度；出口段直线流道长度5000μm，与编码微球流道出口段夹角为120度。

通过控制连续U型流道的总长度，以及连续U型流道中各直线流道的长度，能进一步帮助更精准地控制流阻，帮助更精准地调节流速，从而提高有效液滴的生成率。

再一方面，本发明提供了一种液滴生成器，包括细胞流道、编码微球流道和油相流道，所述细胞流道、编码微球流道和油相流道上都设有连续U型流道，其中编码微球流道的连续U型流道为如上所述的大拐角连续U型流道。

本实用新型提供的用于编码微球流道的大拐角连续U型流道，具有如下的有益效果：

1、使转弯处的半径控制在适当大的范围，使编码微球悬液在经过转弯半径更大的转弯处，并通过控制流速，使其中的灰尘、微纤维等杂质无法在转弯处堆积，从而解决了编码微球悬液经长时间运行易在转弯处堵塞的问题；

2、提高流阻，精准控制流速，提高有效液滴的比例；

5、结构简单、便捷高效、成本低，易于推广。

附图说明

图1为大拐角连续U型流道结构示意图；

图2为包括大拐角连续U型流道的编码微球流道结构示意图；

图3为单细胞单编码微球液滴生成器流道结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型的优选实施例作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本实用新型的理解，而对其不起任何限定作用。本实用新型具体实施例中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1本实用新型提供的用于编码微球流道的大拐角连续U型流道

本实施例提供的用于编码微球流道的大拐角连续U型流道如图1～3所示，其中图1为大拐角连续U型流道结构示意图；图2为包括大拐角连续U型流道的编码微球流道结构示意图；图3为单细胞单编码微球液滴生成器流道结构示意图。

如图2所示，大拐角连续U型流道10为属于编码微球流道20的一部分。

如图1所示，用于编码微球流道20的大拐角连续U型流道10包括第一转弯处1、第二转弯处2、连接两个转弯处的直线流道3、入口段直线流道4和出口段直线流道5。其中第一转弯处1的转弯半径6的尺寸大于编码微球流道20宽度的6倍，第二转弯处2的转弯半径7的尺寸也大于编码微球流道宽度的6倍。由于编码微球直径较大，一般有50μm左右，因此无法采用孔径小于50μm的滤膜进行过滤，导致编码微球悬液会残存一些灰尘、微纤维等杂质。当采用普通连续U型流道(如图3中细胞流道的连续U型流道8)时，在连续使用过程中，编码微球悬液中的灰尘、微纤维等杂质容易在连续U型流道的转弯处逐渐堆积，造成阻塞，严重影响液滴的制备效率和质量。本实施例通过为编码微球悬液设置大拐角的连续U型流道10，使转弯处(第一转弯处1或第二转弯处2)的半径控制在适当大的范围，当编码微球悬液在经过转弯半径更大的转弯处时，在一定的流速下，其中的灰尘、微纤维等杂质无法在转弯处堆积，从而解决了编码微球悬液经长时间运行易在转弯处的堵塞问题。

比如本实施例中编码微球悬液的流速为0.01-0.1μL/s，编码微球悬液在该流速下在经过转弯半径更大的转弯处时，其中的灰尘、微纤维等杂质会全部被冲走，根本无法在转弯处形成堆积；但是在同样流速时，如果转弯半径较小，则编码微球悬液中的灰尘、微纤维等杂质很有可能会来不及被带走而逐渐沉积下来，随着灰尘、微纤维等杂质的沉积越来越多，流阻越来越大，流速越来越小，使沉积现象进一步加重，长时间运行就会造成堵塞。大量研究证明，针对编码微球悬液的流速为时0.01-0.1μL/s，只需控制连续U型流道10的转弯处半径为编码微球流道20宽度的6倍以上时，编码微球悬液中的灰尘、微纤维等杂质就无法在转弯处堆积，从而保证了编码微球流道20的长时间畅通运行。

第一转弯处1、第二转弯处2都为弧形流道，可以呈规整的圆弧形，也可以是由多段半径不同的圆弧形流道组成的弧形流道，但其中至少有一段圆弧形的半径必须为流道宽度的6倍以上。

直线流道3与入口段直线流道4可以相互平行或不平行，直线流道3与出口段直线流道5 可以相互平行或不平行。本实施例中直线流道3与入口段直线流道4相互不平行，直线流道 3与入口段直线流道4沿第一转弯处1的延长线相互交叉成锐角；直线流道3与出口段直线流道5相互不平行，直线流道3与出口段直线流道5沿第二转弯处2的延长线相互交叉成锐角。

优选地，大拐角连续U型流道10的转弯处半径为编码微球流道20宽度的6倍到20倍。这主要是因为连续U型流道10的转弯处半径不可能无限增大，还需考虑到整个微流控系统的布局设置，流道所占的空间面积，以及成本控制，同时也需保证对流阻的适当控制，从而控制编码微球流速，保证有效液滴的生成。本实施例中，大拐角连续U型流道10的转弯处半径为编码微球流道20宽度的10倍。因为实验证明，当连续U型流道10的转弯处半径为编码微球流道20宽度的10倍时，既能保证编码微球悬液中的灰尘、微纤维等杂质无法在转弯处堆积，又能更好地控制流阻，从而帮助稳定编码微球流速，进一步提高有效液滴的生成效率。

连接两个转弯处的直线流道3可以呈水平布置，也可以稍微向上倾斜布置。在本实施例中，如图1所示，连接两个转弯处的直线流道3稍向上倾斜(所述向上是指向流体的上游方向)，这样可以帮助提高流阻，更有利于稳定控制流速。

优选的，如图1和2所示，大拐角连续U型流道10的入口段直线流道4与编码微球流道入口段9的夹角11大于90度(编码微球流道入口段9与编码微球流道入口25直接相连)；大拐角连续U型流道10的出口段直线流道5与编码微球流道出口段12的夹角13大于90度。这样设置是为了保证连续U型流道10大弯大拐的同时，连续U型流道10与其他直线流道的连接处也需保证大弯大拐，避免出现小于90度的拐弯。这样的设计既能使编码微球悬液从其他直线流道顺利过渡到连续U型流道10，以及从连续U型流道10顺利过渡到其他直线流道，又能防止编码微球悬液中的灰尘、微纤维等杂质的堵塞。

优选的，本实施例中，编码微球流道20宽度为50μm，大拐角连续U型流道10的转弯处半径为500μm。所有编码微球流道20的宽度都是一致的，连续U型流道10为编码微球流道20的一部分，连续U型流道10的宽度与编码微球流道20其他部分宽度也都是一致的。

优选的，大拐角连续U型流道10的总长度为20000μm；其中连接两个转弯处的直线流道3向上倾斜，与水平线夹角14为15度，长度为6240μm；入口段直线流道4长度为5000μ m，与编码微球流道入口段9的夹角11为120度；出口段直线流道5长度为5000μm，与编码微球流道出口段12的夹角13为120度。通过控制连续U型流道10的总长度，以及连续U型流道10中各直线流道的长度，能进一步帮助更精准地控制流阻，帮助更精准地调节流速，从而提高有效液滴的生成率。

实施例2本实用新型提供的液滴生成器

本实施例提供的液滴生成器为单细胞单编码微球液滴生成器，如图3所示，包括细胞流道21、编码微球流道20和油相流道22，细胞流道21、编码微球流道20和油相流道22上都设有连续U型流道，细胞流道21上设有连续U型流道8，油相流道22上设有连续U型流道23，编码微球流道20上设有实施例1提供的大拐角连续U型流道10。

实施例3转弯处半径对制备单细胞单编码微球液滴的影响

本实施例采用实施例2提供的单细胞单编码微球液滴生成器制备单细胞单编码微球液滴，其中编码微球流道的大拐角连续U型流道的转弯处半径分别采用流道宽度的3倍(150 μm)、6倍(300μm)、10倍(500μm)、15倍(750μm)、20倍(1000μm)、25倍 (1250μm)，编码微球悬液中的编码微球采用6％聚乙二醇水凝胶微球(50～55μm)，细胞相为10000HEK293T细胞(ATCC)悬浮于100μl细胞缓冲液(50mM Tris，75mM KCl， 3mM MgCl

表1、转弯处半径对制备单细胞单编码微球液滴的影响

由表1可见，当转弯处半径为流道宽度的3倍时，经一小时连续运行后出现明显堵塞现象，导致流阻逐渐升高，流速逐渐降低，液滴产生速度下降，其中有效液滴的占比也明显下降；当转弯处半径升高为流道宽度的6倍时，在编码微球入口压力产生的流速下，编码微球悬液中的灰尘、微纤维等杂质难以在转弯处堆积，因此避免了堵塞现象，使流阻和流速始终保持稳定，产生了更多的液滴，有效液滴占比也升高至；随着转弯处半径的继续增大，流阻变小，流速加快，生成液滴数加快，但是由于流速过快，控制难度加大，生成有效液滴的比例出现下降。另外，从加工方面和流道整体布局方面考虑，转弯处半径也不宜过大，本实施例优选转弯处半径为流道宽度的10倍，此时流速稳定保持为0.060μL/s，有效液滴占比达到71.06％。

实施例4连接两个转弯处的直线流道向上倾斜角度对制备单细胞单编码微球液滴的影响

本实施例采用实施例2提供的单细胞单编码微球液滴生成器制备单细胞单编码微球液滴，大拐角连续U型流道的转弯处半径为流道宽度的10倍，其中连接两个转弯处的直线流道，向上倾斜的角度分别为0度、5度、10度、15度、20度、25度、30度，控制编码微球流道入口处压力为3.0psi，细胞流道入口处压力为4.5psi，油相流道入口处压力为8.5psi，检测流道的流阻和流速变化情况、以及经一小时连续运行后是否有堵塞情况，并取样比较生成的液滴总数和有效液滴数，并计算有效液滴占比，考察大拐角连续U型流道中连接转弯处两个转弯处的直线流道向上倾斜的角度，对制备单细胞单编码微球液滴的影响，结果如表 2所示。

表2、连接两个转弯处的直线流道向上倾斜角度对制备单细胞单编码微球液滴的影响

由表2可见，连接两个转弯处的直线流道向上倾斜的角度对有效液滴的产生比例存在较大影响，这可能是由于不同倾斜角度产生的流阻不同，从而对流速产生影响，进而影响了有效液滴的生成。当两个转弯处的直线流道向上倾斜的角度分别为5度时，经一小时连续运行后较稳定，没有出现明显堵塞现象，流速较快，液滴产生速度较快，有效液滴的占比为61.88％；随着倾斜角度的加大，流阻变大，流速下降，流速变慢，更易控制，有效液滴的占比也明显提高；但是当倾斜角度达到三十度时，流阻较大，流速明显下降，导致再次出现堵塞现象，有效液滴占比迅速下降。因此大拐角连续U型流道中连接转弯处两个转弯处的直线流道，向上倾斜角度优选为10-15度，其中最优选为15度，生成的有效液滴占比最高，达到72.72％。

实施例5大拐角连续U型流道的总长度对制备单细胞单编码微球液滴的影响

本实施例采用实施例2提供的单细胞单编码微球液滴生成器制备单细胞单编码微球液滴，大拐角连续U型流道的转弯处半径为流道宽度的10倍，连接转弯处两个转弯处的直线流道向上倾斜角度为15度，其中大拐角连续U型流道的总长度分别为10000μm、15000μm、20000μm、25000μm、30000μm，其中入口段直线流道长度：连接两个转弯处的直线流道长度：出口段直线长度＝1:1.25:1。控制编码微球流道入口处压力为3.0psi，细胞流道入口处压力为4.5psi，油相流道入口处压力为8.5psi，检测流道的流阻和流速变化情况、以及经一小时连续运行后是否有堵塞情况，并取样比较生成的液滴总数和有效液滴数，并计算有效液滴占比，考察大拐角连续U型流道的总长度对制备单细胞单编码微球液滴的影响，结果如表3所示。

表3、大拐角连续U型流道总长度对制备单细胞单编码微球液滴的影响

由表3可见，大拐角连续U型流道的总长度对有效液滴的产生比例也存在一定的影响，这可能是由于总长度不同，产生的流阻不同，从而对流速产生影响，进而影响了有效液滴的生成。当大拐角连续U型流道的总长度为10000μm时，经一小时连续运行后较稳定，没有出现明显堵塞现象，但流速较快，液滴产生速度较快，有效液滴的占比稍低；随着大拐角连续U型流道的总长度的加大，流阻变大，流速下降，流速变慢，更易控制，有效液滴的占比也出现上升现象；但是总长度达到30000μm时，因流阻较大，流速明显下降，有效液滴占比也明显下降。因此大拐角连续U型流道的总长度优选为15000～25000μm，其中最优选为20000μm，生成的有效液滴占比最高。

虽然本实用新型披露如上，但本实用新型并非限定于此。如根据其微流控领域的应用范围均可做扩展。任何本领域技术人员，在不脱离本实用新型的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本实用新型的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。