基于肿瘤前哨淋巴结探测的荧光造影剂及其制备方法

技术领域

本发明属于医学诊断成像技术领域，涉及一种用于肿瘤前哨淋巴结探测的荧光造影剂，特别是涉及一种能够在近红外二区成像的荧光造影剂。

背景技术

癌症严重威胁着全人类的健康。癌症转移是引起患者死亡的主要原因之一，其中，淋巴转移是常见的肿瘤转移方式之一，而前哨淋巴结被定义为原发肿瘤第一个接受淋巴引流的淋巴结。因此，准确诊断淋巴结转移，对制定治疗策略和评估患者预后至关重要。

传统的前哨淋巴结活检方法是蓝色染料法和核素示踪法，但均因有一定程度的缺陷而限制了其临床普及。

近红外荧光成像由于无创、无放射性、操作简单、价格低廉、灵敏度高等优点，近年来已成为疾病探测的有力工具，并已应用于肿瘤患者术前和术中图像引导下的治疗。

近红外荧光成像技术通过减少生物组织的吸收，避免自荧光效应，可以获得良好的成像效果。近红外光谱一般分为第一近红外窗口(NIR-I，650～950nm)和第二近红外窗口(NIR-II，1000～1300nm)，而大多数传统的荧光成像波长集中在近红外一区。

例如，201510098062.5公开了吲哚菁绿-利妥昔单抗在制备乳腺癌前哨淋巴结示踪剂的应用；201810322404.0以马脾铁蛋白为生物纳米模板(壳)，普鲁士蓝纳米粒为“核”，再偶联荧光染料IR-782，制得一种核壳结构的多模态铁蛋白纳米造影剂，用于乳腺癌前哨淋巴结的光声/核磁/荧光三模态造影；201910475031.5公开了一种白蛋白结合型近红外荧光染料(IR820)—马来酰亚胺共轭物，具有体内淋巴结的蓝染肉眼识别和近红外荧光定位双成像功能。

与近红外一区相比，近红外二区具有较低的散射、较低的组织吸收和较低的组织自荧光等优点，具有较高的穿透深度和信噪比，更有希望在生物医学应用中发挥重大作用。

然而，目前报道的近红外二区探针存在水溶性较差、生物安全性不足、毒性大、性能不稳定等问题。与现有的金纳米粒子(Nano Lett., 2011, 11: 2938-43；Nano Lett.,2009, 9: 183-8)和碳基材料(Adv. Mater. Weinheim, 2014, 26: 5646-52；Phys MedBiol, 2009, 54: 3291-301)等合成生物材料相比，由天然生物材料组成的荧光剂可以通过代谢实现生物降解，有效避免异物长期滞留在患者体内造成的严重不良反应，具有较好的生物安全性。因此，开发由天然生物材料组成的荧光剂，在纳米医学的应用中具有很大优势。

黑色素是一种广泛存在于自然界的内源性成分，如墨鱼的墨汁。墨鱼黑色素纳米颗粒具有很高的光热转换效率和良好的生物相容性，已被开发用于肿瘤成像和治疗(ACSNano, 2019, 13: 8618-8629)。然而，将墨鱼黑色素与近红外二区染料结合得到纳米探针，用于肿瘤前哨淋巴结探测，尚未见诸报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于肿瘤前哨淋巴结探测的荧光造影剂及其制备方法，以获得一种安全可靠、灵敏度高的用于肿瘤前哨淋巴结探测的近红外二区荧光造影剂，满足在体内实现淋巴结精准定位成像的要求。

本发明所述的基于肿瘤前哨淋巴结探测的荧光造影剂是以墨鱼黑色素作为载体，将其以氨基聚乙二醇修饰后，通过酰胺键化学结合近红外二区荧光染料得到的荧光造影剂，所述荧光造影剂中近红外二区荧光染料的负载量为9～18wt%。

本发明所述荧光造影剂的粒径为150～300nm。

其中，所述的墨鱼黑色素是从墨鱼墨囊中提取得到的黑色素。所述墨鱼黑色素为黑色不溶物，本发明对其进行氨基聚乙二醇修饰后，可以使其完全水溶。

具体地，所述的氨基聚乙二醇是氨基-聚乙二醇-氨基和/或氨基-聚乙二醇-巯基。

进一步地，本发明所述氨基聚乙二醇的分子量为2～10KDa。

本发明所述的近红外二区荧光染料为具有以下分子结构的荧光染料的一种：

进而，本发明还提供了所述基于肿瘤前哨淋巴结探测的荧光造影剂的制备方法。

1）、以墨鱼墨囊中的墨汁分散形成墨鱼黑色素悬液，并调节其pH值为9～10。

2）、配制氨基聚乙二醇水溶液，并调节pH值为9～10。

3）、将所述氨基聚乙二醇水溶液滴加入墨鱼黑色素悬液中，进行氨基修饰反应得到氨基化墨鱼黑色素溶液。

4）、以近红外二区荧光染料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，形成羧基活化的荧光染料溶液。

5）、将所述氨基化墨鱼黑色素溶液滴加入羧基活化的荧光染料溶液中，控制反应体系的pH值在7～8，进行键合反应得到近红外二区荧光染料标记的墨鱼黑色素造影剂溶液。

进一步地，上述制备方法中，所述氨基化墨鱼黑色素与近红外二区荧光染料的摩尔比优选为1∶(0.5～2)。

更进一步地，上述制备方法中，所述墨鱼黑色素与氨基聚乙二醇的质量比优选为1∶(3～6)。

优选地，本发明是将所述氨基聚乙二醇溶于水中得到浓度为4～10mg/mL的氨基聚乙二醇水溶液。

更具体地，本发明是将近红外二区荧光染料、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按照摩尔比1∶(1～2.5)∶(1～2.5)溶于N,N-二甲基甲酰胺中，搅拌1～3h以形成羧基活化的荧光染料溶液。

更具体地，上述制备方法中，所述键合反应的时间优选为12～20h。

进一步地，本发明所述制备方法还包括将键合反应得到的墨鱼黑色素造影剂溶液进行透析和离心浓缩处理，以得到最终的荧光造影剂。

具体地，是将墨鱼黑色素造影剂溶液在去离子水中避光透析24h除去溶剂DMF，再采用30KD的超滤离心管，以转速3000～4000rpm离心浓缩至溶液浓度为1～10mg/mL，得到荧光造影剂。

本发明制备的荧光造影剂可以作为肿瘤前哨淋巴结造影剂应用。

本发明的荧光造影剂以墨鱼黑色素为载体，并利用氨基聚乙二醇修饰提高了墨鱼黑色素的水溶性，具有天然的生物相容性和生物降解性，可以大大提高近红外二区荧光染料在体内的水溶性和生物安全性。

本发明荧光造影剂通过化学键合近红外二区荧光染料，具有较低的散射、较低的组织吸收、较低的组织自荧光、较高的穿透深度和信噪比等优点。

本发明荧光造影剂的粒径约为150～300nm，大于毛细血管内皮间隙(20～50nm)，小于淋巴管内皮间隙(120～500nm)，恰当的粒径，使得荧光造影剂具有优良的淋巴结靶向性。

本发明提供的基于肿瘤前哨淋巴结探测的荧光造影剂不仅提高了近红外二区荧光染料的水溶性和生物相容性，而且充分利用墨鱼黑色素的合适粒径，延长了荧光造影剂在体内的循环时间和淋巴部位的滞留，具有穿透深度高、灵敏性高、信噪比高、淋巴结靶向性强、生物安全性好等优势，在肿瘤前哨淋巴结探测应用中显示出巨大的前景。

附图说明

图1是实施例1制备荧光造影剂的透射电镜图。

图2是实施例1制备荧光造影剂的水合半径分布图。

图3是实施例1中氨基化墨鱼黑色素和荧光造影剂的紫外-可见-近红外吸收光谱图。

图4是实施例1中氨基化墨鱼黑色素和荧光造影剂的荧光强度图。

图5是实施例1荧光造影剂不同给药时间对肿瘤转移前哨淋巴结的荧光成像结果。

图6是实施例1荧光造影剂给药24h后，解剖小鼠各器官的荧光成像结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例和应用例作进一步的详细描述。以下实施例和应用例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，从而使本领域技术人员能很好地理解和利用本发明，而不是限制本发明的保护范围。

本发明实施例和应用例中涉及到的实验方法、生产工艺、仪器以及设备，其名称和简称均属于本领域内常规的名称，在相关用途领域内均非常清楚明确，本领域内技术人员能够根据该名称理解常规工艺步骤并应用相应的设备，按照常规条件或制造商建议的条件进行实施。

本发明实施例和应用例中使用的各种原料或试剂，并没有来源上的特殊限制，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明提供了一种用于肿瘤前哨淋巴结探测的近红外二区荧光造影剂，以氨基聚乙二醇修饰的墨鱼黑色素为载体，再通过酰胺键化学结合近红外二区荧光染料制成。其墨鱼黑色素为墨鱼墨囊中提取的黑色素，氨基聚乙二醇主要指双氨基化聚乙二醇和氨基-巯基化聚乙二醇，分子量2KDa～5KDa，近红外二区荧光染料为羧基端近红外二区荧光染料。所述荧光造影剂的粒径为150～300nm。

本发明用于肿瘤前哨淋巴结探测的近红外二区荧光造影剂可以按照以下具体操作步骤制备得到。

S1. 新鲜墨鱼解剖得到墨囊，将墨囊中的墨汁悬液用水冲洗取出收集，然后分别用去离子水和乙醇冲洗6～10次，5000～12000rpm离心15～30min，最终超声分散形成墨鱼黑色素悬液。

S2. 取一定量步骤S1所得悬液，调节pH值为9～10。

S3. 称取一定量的氨基聚乙二醇，溶于水中，调节pH值为9～10。

S4. 将S3所得溶液逐滴加入S2中，搅拌12～20h，以去离子水洗涤、离心，超滤离心管浓缩，得到氨基化墨鱼黑色素溶液。

S5. 称取一定量的近红外二区荧光染料、EDC和NHS溶于DMF中，搅拌1～3h活化羧基。

S6. 将S4所得溶液逐滴加入到S5所得溶液中，加入三乙胺调整pH值在7～8，反应12～20h后，以去离子水避光透析24h，超滤离心管浓缩，得到近红外二区荧光染料标记的墨鱼黑色素造影剂。

其中，墨鱼黑色素与氨基聚乙二醇的质量比为1∶(3～6)，氨基化墨鱼黑色素与近红外二区荧光染料的摩尔比为1∶(0.5～2)。

所述的超滤离心管浓缩采用截留分子量为30KD的超滤离心管，离心转速为3000～4000rpm。

本发明制备的墨鱼黑色素荧光造影剂具有以下特点：1、近红外二区成像，具有较高的穿透深度；2、解决了近红外二区荧光染料水溶性差、生物安全性不足的缺点，具有良好的生理稳定性和生物相容性；3、淋巴结靶向性强，可以作为肿瘤前哨淋巴结探测的理想探针。

实施例1。

取新鲜解剖的墨鱼墨囊，用水冲洗出墨囊中的墨汁悬液并收集，加去离子水清洗，8000 rpm离心15min，收集黑褐色沉淀，再加入无水乙醇清洗，同样条件离心，收集黑褐色沉淀。重复上述清洗步骤6次，最后用去离子水清洗，冷冻干燥得到墨鱼黑色素。

称取6mg墨鱼黑色素于6mL去离子水中，超声分散，得到1mg/mL的墨鱼黑色素悬液，调节pH值为9。

称取30mg氨基-聚乙二醇-氨基(数均分子量5KDa)溶于6mL水中，配制得到5mg/mL的水溶液，调节pH值为9。

将上述水溶液逐滴加入墨鱼黑色素悬液中，搅拌18h，用去离子水洗涤，30KD超滤离心管离心，得到氨基化墨鱼黑色素(inkMNP-PEG)溶液。

取110μL浓度为5mg/mL的近红外二区荧光染料H2、0.5mg EDC和0.5mg NHS，溶于2mL DMF中，搅拌2h活化羧基。

将2mL氨基化墨鱼黑色素溶液逐滴加入到上述活化羧基的荧光染料溶液中，加入三乙胺调整pH值到7，反应20h后，去离子水避光透析24h，超滤离心管3500rpm浓缩，得到近红外二区荧光染料负载量为9%的墨鱼黑色素荧光造影剂(inkMNP-PEG-H2)。

在透射电镜下观察上述制备的墨鱼黑色素荧光造影剂，结果如图1，造影剂粒径约为220nm，纳米粒形貌呈球形，单分散性好。

图2进一步给出了所合成墨鱼黑色素荧光造影剂的水合半径分布图，显示纳米粒的水合半径为255nm，分散性较好，有利于在淋巴结部位滞留。

图3为氨基化墨鱼黑色素和墨鱼黑色素荧光造影剂的紫外-可见-近红外吸收光谱，显示墨鱼黑色素荧光造影剂较氨基化墨鱼黑色素在600～1000nm的近红外区有强吸收。

图4为氨基化墨鱼黑色素和墨鱼黑色素荧光造影剂的荧光强度图。图中可见墨鱼黑色素荧光造影剂的荧光显像，而氨基化墨鱼黑色素未见荧光。

实施例2。

取新鲜解剖的墨鱼墨囊，用水冲洗出墨囊中的墨汁悬液收集，去离子水清洗，10000rpm离心15min，收集黑褐色沉淀，再加入无水乙醇清洗，同样条件离心收集黑褐色沉淀。重复上述清洗步骤6次，最后用去离子水清洗，冷冻干燥得到墨鱼黑色素。

称取6mg墨鱼黑色素于6mL去离子水中，超声分散，得到1mg/mL的墨鱼黑色素悬液，调节pH值为9.5。

称取20mg氨基-聚乙二醇-巯基(数均分子量10KDa)溶于5mL水中，配制得到4mg/mL的水溶液，调节pH值为9.5。

将上述水溶液逐滴加入墨鱼黑色素悬液中，搅拌15h，用去离子水洗涤，30KD超滤离心管离心，得到氨基化墨鱼黑色素溶液。

取150μL浓度为6mg/mL的近红外二区荧光染料H2、0.5mg EDC和0.5mg NHS，溶于2mL DMF中，搅拌2h活化羧基。

将2mL氨基化墨鱼黑色素溶液逐滴加入到上述活化羧基的荧光染料溶液中，加入三乙胺调整pH值到7，反应18h后，去离子水避光透析24h，超滤离心管3500rpm浓缩，得到近红外二区荧光染料负载量为15%的墨鱼黑色素荧光造影剂。

实施例3。

取新鲜解剖的墨鱼墨囊，用水冲洗出墨囊中的墨汁悬液收集，去离子水清洗，12000rpm离心15min，收集黑褐色沉淀，再加入无水乙醇清洗，同样条件离心收集黑褐色沉淀。重复上述清洗步骤6次，最后用去离子水清洗，冷冻干燥得到墨鱼黑色素。

称取6mg墨鱼黑色素于6mL去离子水中，超声分散，得到1mg/mL的墨鱼黑色素悬液，调节pH值为10。

称取15mg氨基-聚乙二醇-氨基(数均分子量2KDa)和15mg氨基-聚乙二醇-巯基(数均分子量2KDa)溶于3mL水中，配制得到10mg/mL的水溶液，调节pH值为10。

将上述水溶液逐滴加入墨鱼黑色素悬液中，搅拌15h，用去离子水洗涤，30KD超滤离心管离心，得到氨基化墨鱼黑色素溶液。

取270μL浓度为4mg/mL的近红外二区荧光染料Q4、0.5mg EDC和0.5mg NHS，溶于2mL DMF中，搅拌3h活化羧基。

将2mL氨基化墨鱼黑色素溶液逐滴加入到上述活化羧基的荧光染料溶液中，加入三乙胺调整pH值到7，反应18h后，去离子水避光透析24h，超滤离心管3500rpm浓缩，得到近红外二区荧光染料负载量为18%的墨鱼黑色素荧光造影剂。

应用例1。

通过向雄性健康ICR小鼠右后足足垫皮下接种4T1细胞，建立肿瘤前哨淋巴结转移模型。

采用实施例1制备得到的墨鱼黑色素荧光造影剂，通过皮下注射于荷瘤小鼠右后足足垫，检测荧光成像效果。

如图5所示，墨鱼黑色素荧光造影剂皮下注射于荷瘤小鼠右后足足垫，10min后，腘窝淋巴结(前哨淋巴结)和坐骨淋巴结(次级淋巴结)处开始有荧光信号出现，且随着时间延长信号逐渐增强，1h后荧光强度达到顶峰。此外可见两者间的淋巴管显像。

如图6所示，墨鱼黑色素荧光造影剂皮下注射荷瘤小鼠右后足足垫后24h解剖，淋巴结中的荧光强度远高于其在肝肾等排泄器官中的强度，证明墨鱼黑色素荧光造影剂具有明显的淋巴靶向性，可实现对淋巴结很好的示踪。

最后应该说明的是，本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。