抑制缺氧诱导因子2活性的苯并异噻唑类化合物、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，尤其涉及一种抑制缺氧诱导因子2活性的苯并异噻唑化合物，还涉及其制备方法和应用。

背景技术

缺氧环境作为肿瘤微环境的常见特征可推动肿瘤进展。患者肿瘤内部缺氧与不良预后及对化疗耐药密切相关。缺氧诱导因子2(hypoxia-inducible factor 2,HIF-2)是一种在缺氧相关通路发挥主导作用的转录因子，其由缺氧诱导因子2α(HIF-2α)及芳香烃受体核转位因子(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT)两个亚基异源二聚而成。HIF-2的水平受到细胞中氧含量的严格调控。在多种癌细胞(如肾癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌等)中均可检测出HIF-2α蛋白。尤其是在肾细胞癌中，肾细胞癌中VHL蛋白普遍突变失活导致HIF-2α蛋白不受控制的积累，最终引起HIF-2转录活性显著上升(Cancer.Discov.7,1284-1305(2017))。HIF-2的激活促使其下游多种促癌基因如血管表皮生长因子A(VEGFA)、细胞周期素D1(CCND1)、原癌基因MYC等的过表达(Circ.Res.95,146-153(2004)；Nat.Genet.44,420-425(2012)；Nat.Commun.7,13183(2016))，从而从多个维度推动肿瘤进展。

抑制HIF-2活性可以在一定程度上达到癌症治疗效果，目前HIF-2α变构抑制剂结构类型较少，主要为含四氮唑类结构单元的四氮唑类HIF-2α抑制剂和以氧原子连接两个取代苯环为结构特征的双环类HIF-2α抑制剂。四氮唑类HIF-2α抑制剂可能由于成药性问题无后续报道，而双环类HIF-2α抑制剂PT2385、MK-6482(PT2977)，在治疗肾细胞癌的临床II期试验中展现出了良好疗效。随后MK-6482在2020年1月以Belzutifan为通用名进入了治疗肾细胞癌的临床III期试验(NCT04195750)；采用HIF-2α抑制剂治疗肾细胞癌是一种有效的策略。

发明内容

发明目的：本发明提供一种抑制缺氧诱导因子2活性的苯并异噻唑化合物，还提供了上述化合物的制备方法及应用。

技术方案：本发明所述的一种抑制缺氧诱导因子2活性的苯并异噻唑类化合物，所述化合物的通式如式I：

其中Ar

R

R

当R

上述抑制缺氧诱导因子2活性的苯并异噻唑类化合物的制备方法，包括以下步骤：将式II所示化合物与III所示的溴取代物，加入碱形成碱条件，在反应溶剂中发生亲核取代反应，得到式I所示苯并异噻唑类化合物。

优选的，所述反应溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲苯、丙酮、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)；所述碱为有机碱或无机碱，包括碳酸钠、碳酸钾，碳酸铯、氢氧化钠、氢氧化钾或三乙胺，反应温度为20～60℃，反应时间为2～24小时。

进一步的，当式I的化合物R

本发明还公开了上述化合物在制备治疗或预防癌症药物中的应用。

优选的，所述治疗或预防癌症药物包括式I所示苯并异噻唑类化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体或立体异构体。

优选的，所述癌症包括肾脏、肝脏的实体瘤，如肾细胞癌、肝癌等恶性肿瘤。

本发明的化合物临床所用剂量为0.01mg-1000mg/天，也可根据病情轻重或剂型的不同偏离此范围。在某些实施方案中，式(I)的化合物含有足以形成盐的酸性官能团。代表性的盐包括可药用金属盐如钠、钾、锂、钙、镁、铝和锌盐；可药用金属阳离子如钠、钾、锂、钙、镁、铝和锌的碳酸盐和碳酸氢盐；可药用有机伯胺、仲胺和叔胺，包括脂肪胺、芳香胺、脂肪二胺和羟基烷基胺，如甲胺、乙胺、2-羟基乙基胺、二乙胺、三乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇。

本发明所述的抑制缺氧诱导因子2活性的苯并异噻唑类化合物可与HIF-2α-PASB结构域中的内部空腔结合，从而抑制HIF-2α与ARNT二聚，最终导致HIF-2二聚体含量下降，HIF-2的转录活性下降。这同样将促使HIF-2下游的促癌基因，如血管表皮生长因子A、细胞周期素D1、原癌基因MYC等的表达被抑制。该类化合物具有抗肿瘤方面医药用途，可用于制备抗肿瘤药物。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

(1)本发明化合物对于缺氧诱导因子2的转录活性的抑制效果较好，在低浓度下即可达到对转录活性的较高抑制；在20μM浓度下，部分化合物在荧光素酶报告基因实验中对HIF-2的抑制效应就能超过50％；

(2)实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应实验(RT-PCR)中，本发明化合物可有效抑制缺氧诱导因子2的转录活性及其下游促癌基因表达；如化合物5，其在20μM浓度下可将血管表皮生长因子A水平降至38.1％；

(3)在平板克隆形成实验中，本发明化合物可有效抑制癌细胞株增殖；如化合物5，其在20μM浓度下处理14天对786-O细胞克隆形成抑制至5.4％，表明本发明化合物拥有一定的抗肿瘤活性。

附图说明

图1为荧光素酶报告基因实验测试化合物对HIF-2转录活性的抑制作用；

图2为RT-PCR实验测试化合物对HIF-2下游促癌基因抑制效应图；

图3为平板克隆形成实验测试对每孔拍照计算观察克隆数量示意图；

图4为平板克隆形成实验测试化合物对肾细胞癌细胞株786-O克隆形成的抑制效应图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

N-(1-苯乙基)苯并[d]异噻唑-3-胺(1)

将3-氯苯并异噻唑(200mg,1.18mmol,1.0eq)溶于DMF(4mL)，加入碳酸铯(576mg,1.77mmol,1.5eq)和1-苯乙胺(142.9mg,1.18mmol,1.0eq)。氮气保护下室温搅拌反应4小时。反应完毕后加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取(3×20mL)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝15:1～5:1)，得目标化合物1。Yellowoil.122.3mg.Yield 40.8％.

实施例2

N-(2-苯基丙-2-基)苯并[d]异噻唑-3-胺(2)

按照实施例1的实验方法，使用α,α-二甲基苄胺替换1-苯乙胺得到目标化合物2。White solid.136.7mg.Yield 43.2％.mp 73.1-74.4℃.

实施例3

N-(1-苯基环丙基)苯并[d]异噻唑-3-胺(3)

按照实施例1的实验方法，使用1-苯基环丙胺替换1-苯乙胺得到目标化合物3。White solid.120.9mg.Yield 38.5％.mp 64.9-65.7℃.

实施例4

N-(2-氟苄基)苯并[d]异噻唑-3-胺(4)

按照实施例1的实验方法，使用2-氟苄胺替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物4。White solid.159.0mg.Yield 52.2％.mp 52.4-55.3℃.

实施例5

N-(3-氟苄基)苯并[d]异噻唑-3-胺(5)

按照实施例1的实验方法，使用3-氟苄胺替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物5。White solid.185.1mg.Yield 60.8％.mp 86.4-87.5℃.

实施例6

N-(4-氟苄基)苯并[d]异噻唑-3-胺(6)

按照实施例1的实验方法，使用4-氟苄胺替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物6。White solid.112.1mg.Yield 36.8％.mp 51.9-53.0℃.

实施例7

N-(3,5-二氟苄基)苯并[d]异噻唑-3-胺(7)

按照实施例1的实验方法，使用3,5-二氟苄胺替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物7。White solid.230.6mg.Yield 70.8％.mp 71.9-72.4℃.

实施例8

N-(3-氯苄基)苯并[d]异噻唑-3-胺(8)

按照实施例1的实验方法，使用3-氯苄胺替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物8。White solid.175.6mg.Yield 54.3％.mp 91.3-92.2℃.1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ8.18(d,J＝8.1Hz,1H),8.08(t,J＝6.1Hz,1H),7.95(dd,J＝8.1,0.9Hz,1H),7.54(dd,J＝8.1,7.0Hz,1H),7.45–7.40(m,2H),7.36(d,J＝5.3Hz,2H),7.33–7.28(m,1H),4.65(d,J＝5.9Hz,2H).

实施例9

N-(3-溴苄基)苯并[d]异噻唑-3-胺(9)

按照实施例1的实验方法，使用3-溴苄胺替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物9。White solid.248.4mg.Yield 66.2％.mp 103.5-105.5℃.

实施例10

3-((苯并[d]异噻唑-3-基氨基)甲基)苯甲腈(10)

按照实施例1的实验方法，使用3-氰基苄胺替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物10。White solid.100.4mg.Yield 32.1％.mp 53.8-55.1℃.

实施例11

N-(3-甲氧基苄基)苯并[d]异噻唑-3-胺(11)

按照实施例1的实验方法，使用3-甲氧基苄胺替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物11。White solid.88.0mg.Yield 47.6％.mp 111.4-113.7℃.

实施例12

3-((苯并[d]异噻唑-3-基氨基)甲基)苯酚(12)

按照实施例1的实验方法，使用3-羟基苄胺替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物12。Colorless oil.106.8mg.Yield 35.2％.

实施例13

N-(3-(三氟甲基)苄基)苯并[d]异噻唑-3-胺(13)

按照实施例1的实验方法，使用3-三氟甲基苄胺替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物13。White solid.157.0mg.Yield 43.2％.mp 126.8-128.2℃.

实施例14

3-((苯并[d]异噻唑-3-基氨基)甲基)苯甲酸甲酯(14)

按照实施例1的实验方法，使用3-(氨甲基)苯甲酸甲酯替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物14。White solid.130.4mg.Yield 41.2％.mp 47.7-49.4℃.

实施例15

3-((苯并[d]异噻唑-3-基氨基)甲基)苯甲酸(15)

将化合物14(600mg,2.011mmol)溶于THF(15mL)、MeOH(5mL)和水(5mL)的混合溶剂中，加入LiOH(127mg,3.016mmol)。反应液于室温搅拌4小时。反应完毕后，减压蒸除溶剂，加入水(20mL)，混合物用乙酸乙酯(3×15mL)萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥后通过柱层析纯化得到目标化合物YYC87。White solid.400.0mg.Yield 75.2％.mp 223.9-224.7℃.

实施例16

N-(2-(3-氟苯基)丙-2-基)苯并[d]异噻唑-3-胺(16)

按照实施例1的实验方法，使用2-(3-氟苯基)丙-2-胺替换1-苯乙胺得到目标化合物16。colorless oil.127.3mg.Yield 37.6％.

实施例17

(3-((苯并[d]异噻唑-3基氨基)甲基)苯基)甲醇(17)

按照实施例1的实验方法，使用3-羟甲基苄胺替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物17。White solid.173.1mg.Yield 54.3％.mp 126.8-128.2℃.

实施例18

5-氟-N-(3-氟苄基)苯并[d]异噻唑-3-胺(18)

将5-氟-3-氨基苯并异噻唑(198.5mg,1.18mmol,1.0eq)溶于DMF(5mL)，加入碳酸钾(244.3mg,1.77mmol,1.5eq)和3-氟苄溴(223.1mg,1.18mmol,1.0eq)。氮气保护下室温搅拌反应4小时。反应完毕后加入水(20mL)，乙酸乙酯萃取(3×20mL)，合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝15:1～5:1)，得目标化合物18。Whitesolid.191.6mg.Yield 58.6％.mp 98.3-99.6℃.

实施例19

5-溴-N-(3-氟苄基)苯并[d]异噻唑-3-胺(19)

按照实施例18的实验方法，使用5-溴-3-氨基苯并异噻唑替换5-氟-3-氨基苯并异噻唑得目标化合物19。White solid.146.3mg.Yield 36.8％.mp 118.8-120.2℃.HRMS(ESI)for C14H10BrFN2S[M+H]+:336.9803.tR＝9.346min,HPLC purity:98.1％.

实施例20

5-氟-N-(3-氟苄基)-6-(三氟甲基)苯并[d]异噻唑-3-胺(20)

按照实施例18的实验方法，使用3-氨基-5-氟-6-(三氟甲基)苯并异噻唑替换5-氟-3-氨基苯并异噻唑得到目标化合物20。White solid.132.3mg.Yield 32.6％.mp126.8-128.2℃.HRMS(ESI)for C15H9F5N2S[M+H]+:345.0479.tR＝12.758min,HPLCpurity:95.6％.

实施例21

N-(3-氟苄基)-6-甲基苯并[d]异噻唑-3-胺(21)

按照实施例18的实验方法，使用3-氨-5-甲基苯并异噻唑替换5-氟-3-氨基苯并异噻唑得到目标化合物21。light red oil.92.8mg.Yield 28.9％.

实施例22

N-(3-氟苄基)异噻唑并[5,4-b]吡啶-3-胺(22)

按照实施例18的实验方法，使用异噻唑并[5,4-b]吡啶-3-胺替换5-氟-3-氨基苯并异噻唑得到目标化合物22。Pink oil.78.9mg.Yield 25.8％.

实施例23

N-(3-(氨基甲基)苄基)苯并[d]异噻唑-3-胺(23)

按照实施例1的实验方法，使用1,3-苯二甲胺替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物23。Colorless oil.154.2mg.Yield 48.5％.

实施例24

N-(吡啶-2-基甲基)苯并[d]异噻唑-3-胺(24)

按照实施例1的实验方法，使用2-氨甲基吡啶替换1-苯乙胺，使用碳酸钾替换碳酸铯得到目标化合物24。Colorless oil.189.9mg.Yield 66.7％.HRMS(ESI)for C13H11N3S[M+H]+:242.0746.tR＝5..738min,HPLC purity:95.2％.

实施例25

(R)-2-(苯并[d]异噻唑-3-基氨基)-2-苯基乙-1-醇(25)

按照实施例1的实验方法，使用(R)-(-)-2-苯甘氨醇替换1-苯乙胺得到目标化合物25。Light yellow oil.113.6mg.Yield 35.6％.

实施例26

(S)-2-(苯并[d]异噻唑-3-基氨基)-2-苯基乙-1-醇(26)

按照实施例1的实验方法，使用(S)-(-)-2-苯甘氨醇替换1-苯乙胺得到目标化合物26。Light yellow oil.119.0mg.Yield 37.3％.

(1)荧光素酶报告基因实验测试本发明部分化合物对HIF-2的抑制活性

实验方法：将含有缺氧诱导元件和荧光素酶基因序列的商用病毒(CLS-007L,Qiagen)转染至透明细胞肾细胞癌细胞株786-O细胞中，得到稳定转染的786-O-HRE工具细胞(J.Med.Chem.61,9691-9721(2018))。将786-O-HRE细胞均匀地接种于96孔白板中。待细胞贴壁，加药组加入相应化合物的二甲亚砜(DMSO)溶液，空白对照组加入最高浓度的DMSO。在37℃、5％CO

E＝(1-加药组发光值/空白对照组发光值)×100％

表1本发明部分化合物在20μM浓度下对HIF-2转录活性的抑制效应

表1数据为本发明部分化合物在20μM浓度下对HIF-2转录活性的抑制效应。活性数据表明本发明中的化合物均有一定程度的HIF-2抑制活性，其中部分化合物如化合物5(56.3±6.7％)、8(48.4±5.3％)、9(48.6±5.5％)、11(43.7±4.8％)、12(53.1±3.9％)、25(46.3±2.9％)等在20μM浓度下的HIF-2抑制活性显著，与20μM浓度的阳性化合物PT2385(48±5.1％)活性相当。

本发明部分化合物在荧光素酶报告基因实验中的EC

表2本发明部分化合物在荧光素酶报告基因实验中的EC

(2)RT-PCR测试本发明部分化合物对HIF-2下游基因的抑制效应

为测试本发明化合物是否能抑制HIF-2下游促癌基因，选用肾细胞癌细胞株786-O为研究工具，测试本发明化合物对786-O细胞中的HIF-2下游促癌基因如VEGFA、CCND1、GLUT1是否有抑制作用。

实验方法：将786-O细胞接种于透明六孔板，在含有10％FBS的RPMI-1640培养基中于37℃、5％CO2培养。待细胞贴壁，在孔中加入相应浓度的本发明化合物，并以最高浓度的DMSO作为对照。24小时后收集细胞，使用总RNA试剂盒(R701,Vazyme)分离RNA，然后使用cDNA逆转录试剂盒(R23-01,Vazyme)进行cDNA合成。

RT-PCR在StepOnePlus qPCR机器(Thermo Fisher Scientific)上采用预混的Syber Geen master mix(Q441,Vazyme)进行。采用ACTB基因用作内参基因。PCR引物序列如下ACTB(F:GCACAGAGCCTCGCCTT,R:GTTGTCGACGACGAGCG)；VEGFA(F:TACCTCCACCATGCCAAGTG,R:ATGATTCTGCCCTCCTCCTTC)；GLUT1(F:TCTGGCATCAACGCTGTCTTC,R:CGATACCGGAGCCAATGGT)；CCND1(F:TGGAGCCCGTGAAAAAGAGC,R:TCTCCTTCATCTTAGAGGCCAC)。

表3本发明部分化合物是否抑制HIF-2下游促癌基因表达

实验结果表明本发明化合物可有效抑制HIF-2下游促癌基因。化合物5实验结果附在附图2中。化合物5可浓度依赖性地抑制HIF-2下游促癌基因如VEGFA、CCND1、GLUT。在20μM浓度下，化合物5在20μM浓度下可将肿瘤血管生成过程中的重要基因VEGFA的水平降至38.1％。这说明该类化合物具有潜在的抗肿瘤效应。

(3)平板克隆形成实验测试本发明部分化合物对癌细胞株的增殖抑制效应

实验方法：取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中备用。将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每孔100个细胞的梯度密度分别接种于含10mL 37℃预温培养液的6孔板中，轻轻转动，使细胞分散均匀。在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。待贴壁后每孔换入含相应浓度本发明化合物(0、1、5、20μM)的完全培养基继续培养，隔天换入新的含药培养基。培养14天后，培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用磷酸盐缓冲溶液小心浸洗2次。加4％多聚甲醛(2mL/孔)固定细胞15分钟。吸弃固定液，加适量结晶紫染色液染色30分钟后，吸弃染色液，磷酸盐缓冲溶液洗两遍，对每孔拍照计算观察克隆数量。

表4本发明部分化合物是否抑制癌细胞株克隆形成

实验结果表明本发明化合物可有效抑制肾细胞癌细胞株786-O、A498及肝癌细胞株HepG2的克隆形成。化合物5抑制786-O克隆形成实验结果如图3，将每孔颜色区域使用imageJ统计做图，结果图4所示。结果表明化合物5可浓度依赖性地抑制786-O细胞的克隆形成，在20μM浓度下化合物5可将肾细胞癌细胞株786-O的克隆形成抑制至5.4％，这说明本发明化合物具有初步的抗肿瘤活性，能够抑制癌细胞株的克隆形成。