SSR-PCR

摘要： 为探索了解西北地区大蒜及其野生蒜资源之间的亲缘关系及变异特性,以25份西北地区及野生大蒜鳞茎和叶片为材料提取模板DNA,筛选适于简单重复序列(SSR)-PCR的反应体系。采用L_(16)(4^(3))正交表设计正交试验并进行单因素试验,对影响大蒜SSR-PCR的相关体系参数进行优化。结果表明,适用于大蒜的SSR反应体系总体积为10μL:模板DNA 30.0 ng,正反引物均为0.5μmol/L,2×Taq PCR Mix 5.0μL,其余用dd H_(2)O补齐。扩增程序:94°C预变性3 min;94°C变性30 s,不同引物最佳退火温度退火45 s,72°C延伸90 s;30次循环的最后1次循环72°C延伸设为10 min,4°C保存扩增产物。最终在上述PCR条件下从50对SSR通用引物中筛选出13对多态性好、稳定性高的适用于大蒜SSR-PCR多样性分析的候选引物。

摘要： 华重楼灰霉病在湖北和湖南两省多有发生,己对华重楼药材生产构成了严重威胁.为明确该病菌的遗传多样性水平,本研究对分离自两省10个地区的92株华重楼灰霉病菌进行了 rDNA-ITS分子鉴定,同时采用SSR-PCR技术进行了遗传多样性分析.rDNA-ITS分子鉴定结果表明92株病原菌均为灰葡萄孢Botrytis cinerea,ITS系统发育树可初步显示其遗传多样性丰富.SSR-PCR多样性分析结果表明,应用9对SSR引物共检测出109个等位基因位点,等位基因和有效等位基因平均值分别为12和3.6589,香农指数和多态信息含量平均值分别为1.5048和0.6196.10个群体各自有效等位基因在1.622-3.971之间;香农指数在0.527-1.582之间;观测杂合度在0.148-0.593之间;期望杂合度在0.321-0.708之间.Nei遗传距离为0.15时,UPGMA聚类树可将92株病菌划分为4个类群.群体间基因流值为0.19-4.67,遗传分化值为0.047-0.638,群体遗传同一性和遗传距离范围值分别为0.1531-0.9679和0.0327-1.8766.综上所述,湖北和湖南两省华重楼灰霉病菌群体存在明显的遗传多样性,这为湖北和湖南两省区华重楼灰霉病的科学防治提供了理论依据.

摘要： 以蒙古冰草(Agropyron mongolicum var.mongolicum)DNA为模板,利用单因素与正交试验设计相结合的方法,对影响冰草SSR-PCR体系的dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度、模板DNA浓度和Taq DNA聚合酶用量5个因素进行优化.结果 表明,冰草SSR-PCR的最佳体系为:dNTP浓度250μmol·L-1、Mg2+浓度2.25 mmol·L-1、引物浓度0.60μmol·L-1、模板DNA浓度40 ng·μL-1和Taq DNA聚合酶用量0.75 U,其余为ddH2O,反应总体积为20μL.本研究筛选出适于冰草SSR-PCR的最佳反应体系,可提高冰草SSR扩增条带的清晰度和可靠性,这为后续深入开展冰草的遗传作图、重要性状QTL定位及分子标记辅助育种等研究奠定了基础.

摘要： 目的:对桂郁金SSR-PCR反应体系进行建立与优化,使其适合分析桂郁金遗传多样性等研究内容.方法:通过正交设计法对PCR反应体系的引物,模板,2×Taq PCR MasterMix(包括Tap DNA聚合酶,dNTPs,缓冲液等)以及扩增程序进行建立和优化.结果:桂郁金SSR-PCR反应的最佳体系是在15μL的反应体系中,DNA模板2.5μL(25 ng·μL-1),引物1.0μL(1.0μmol·L-1),2×Taq PCR MasterMix6μL,其中Tap DNA聚合酶0.05 U·μL-1,Mg2+ 3.0 mmol·L-1,dNTPs0.3 mmol·L-1,加ddH2O至15μL.PCR反应程序的最佳参数设定为变性30 s,退火30 s,延伸45 s,循环35次.结论:建立了桂郁金SSR-PCR反应体系,并通过10份桂郁金材料进行验证,结果显示该体系稳定可靠,可以为桂郁金引物开发,良种选育繁育等相关研究提供参考.

摘要： 为建立稳定可靠的野杏SSR-PCR反应体系,以3个野杏无性系170号、240号、263号和1个西伯利亚杏无性系508号为试验材料,采用L16(45)正交试验设计对影响野杏SSR-PCR反应的5个因素在4个水平上进行优化.结果表明:各因素对反应体系的影响由大到小依次为DNA模板浓度、引物、dNTP、Mg2+、Taq聚合酶.野杏SSR-PCR最佳反应体系(总体积20μL):dNTPs 0.45 mmol/L、Mg2+2 mmol/L、Taq酶1.125 U、引物0.125μmol/L、DNA模板20 ng.选用引物X128和60个野杏样木对该体系进行稳定性验证,扩增产物集中在100～200 bp,稳定度高,多态性良好,该体系可应用于野杏分子标记辅助育种等方面的研究中.

摘要： 以云南金花茶为试验材料,利用试剂盒法、SDS法及CTAB法3种方法提取其DNA,并对3种方法的提取结果进行比较;经初筛合成云南金花茶EST-SSR引物,并对影响SSR-PCR体系的Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物及模板DNA这5个因素进行L16(45)正交实验,以期建立较为稳定的云南金花茶SSR-PCR体系.试验结果表明:试剂盒法提取得到的云南金花茶DNA质量最好且符合SSR分子标记试验.各因素对PCR扩增效果的影响程度为:Mg2+>引物>Taq DNA聚合酶>dNTP>模板DNA.试验最终确定的金花茶SSR-PCR最佳反应体系(20μL)为:2.0μL Taq Buffer、1.5μL Mg2+(25 mmol/L)、0.3μL dNTP(10 mmol/L)、0.2μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、前后引物各0.4μL(10μmol/L)、0.5μL模板DNA(50 ng/μL)、14.7μL ddH2O.建立和优化云南金花茶SSR反应体系,可为云南金花茶不同种群的遗传变异研究提供基础.

摘要： [目的]建立刨花润楠SSR-PCR最佳反应体系,从樟科树种SSR引物中筛选多态性高的引物,并对刨花润楠遗传多样性进行分析.[方法]对影响PCR反应体系的5个因素设置7个水平,利用正交设计L16(45)进行优化,确定最佳体系,并用该体系从187对候选引物中进行引物筛选.利用软件POPGENE1.32、PowerMark-erv3.25、FSTAT、GenAlex6.5、Structure2.3和POPTREE分别计算观测等位基因数目(Na)、观察杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、多态性信息量(PIC)、基因流(Nm),进行群体遗传结构分析和UPGMA法聚类分析.[结果]刨花润楠最佳体系(20μL)为:Taq酶1.0 U、dNTPs 0.25 mmol·L-1、Mg2+1.25 mmol·L-1、引物0.5μmol·L-1、模板50 ng.最终筛选出12对具有多态性高的SSR引物.Na、Ho、He和PIC的平均值分别为15.083、0.576、0.751和0.722,表明种群具有较丰富的遗传多样性;Nm平均值为1.500,种群间存在频繁的基因交流;UPGMA将24个种源聚为3类,与Structure分析结果一致.[结论]本研究成功优化了刨花润楠SSR-PCR反应体系,并获得12对适用于刨花润楠的SSR引物,刨花润楠种群遗传多样性丰富,种群间存在频繁的基因交流,24个种源可聚为3类.

摘要： 以澳洲坚果DNA为模板,通过单因素设计方法对影响SSR-PCR反应体系的5个主要因素进行了优化.结果表明,澳洲坚果SSR-PCR反应体系的最适条件为:20μL的反应体系中,包含30 mg·L-1模板DNA,1.0U Taq聚合酶,2.5 mmol·L-1 Mg2+,0.6tμmol·L-1引物和0.3 mmol·L-1dNTPs.采用该反应体系对不同引物和15份澳洲坚果种质进行验证,扩增条带的可靠性和稳定性良好,且分辨率较高.因此,该SSR-PCR反应体系可用于澳洲坚果种质源鉴定及遗传多样性分析研究.%Five major factors of the SSR-PCR reaction system were optimized for genomic DNA of macadamia (Macadamia spp.) by a single factor design.The volume of optimum reaction system was 20 μL that consisted of 30 mg · L-1 template DNA,1.0 U Taq polymerase,2.5 mmol · L-1 Mg2+,0.6 μmol · L-1 primer and 0.3 mmol · L-1 dNTPs.On 15 germplasms of macadamia using different SSR primers,the system proved to be reliable and stable in the amplification bands with high resolution.Consequently,it seemed adequate for the identification and genetic diversity analysis of macadamia germplasms.