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hex1基因在深绿木霉耐受敌敌畏中的作用

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研究木霉菌耐受有机磷农药分子机理，对于在病害综合防治中协调使用木霉菌剂和化学杀菌剂具有重要意义。本文通过gene walking技术获得hexl基因的两侧序列，再分别使用引物对T23knock-Sac Ⅰ/T23knock- Not Ⅰ和T23knock-Hind Ⅲ/T23knock-Xho Ⅰ扩增hexl的825 bp的5’端和1083 bp的3’端同源臂。首先，将T23knock-Hind Ⅲ/ T23knock-Xho Ⅰ扩增的1083 bp PCR产物用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切并经凝胶电泳回收，连接到同样经双酶切的pV2载体上构成重组质粒pV-T23k2。然后，将T23knock- Sac Ⅰ/T23knock-Not I扩增的825 bp PCR产物用Sac Ⅰ和Not Ⅰ双酶切并经凝胶电泳回收，连接到同样经双酶切的pV-T23k2载体上构成重组质粒pV-T23k2-1。最后，酶切检测并经测序验证敲除载体构建正确。以潮霉素抗性基因为筛选标记，通过PEG介导的原尘质体融合技术获得了近200株转化子，通过在DNA和RNA水平上的进一步检测，最终筛选到1株hexl基因敲除子Ahexl。通过与野生菌T23的比较发现，敲除子Ahexl在PDA培养基上的生长速度稍慢，Ahexl在液体培养基Burk（含DDV 300 μg/ml）培养3d后，敲除子对敌敌畏降解率较野生菌小10%;菌丝电解质外渗差异分析显示，Ahexl菌丝在任一时段的电导率均高于野生菌。通过透射电子显微镜观察发现，在1000μg/ml敌敌畏胁迫下，Ahexl菌丝内容物明显较野生菌破坏严重。为了弄清此种耐受性的差异是否由于菌丝细胞膜组成成分发生了变化而引起，我们对野生木霉菌和敲除子细胞膜的重要组成物质麦角甾醇含量进行了液相色谱分析，未发现它们之间有显著性差异，但根据液相色谱图初步发现有一小分子物质在含量上有明显差异，需进一步鉴定。进一步，构建了含G418抗性标记的hexl互补载体，并初步获得了20株互补子，拟进一步结合对野生菌、敲除子和互补子的性状分析，深入阐释hexl在深绿耐受有机磷农药敌敌畏方面的重要作用。同时，构建了eGFP和hexl基因融合表达载体，转化深绿木霉后通过对菌丝进行激光共聚集显微观察，定位了HEK1蛋白在木霉菌丝的横隔和尖端处表达。

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