Pon-6基因在木霉菌降解敌敌畏中的作用及相关影响因子研究

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本研究通过同源克隆在深绿木霉（Trichoderma atroviride）T23中获得了在哺乳动物中研究甚多的与敌敌畏降解有关的基因pon，设计引物以T23 cDNA为模板扩增通过测序获得了同源性最高的pon-6。用生物信息学软件对PON-6蛋白结构进行了预测，并预测了PON-6与敌敌畏存在互作的Motif，PON-6与敌敌畏可以互作，软件分析推测PON-6浓度是降解敌敌畏的关键因素之一。
　　因此，我们在木霉菌T23中分别构建了pon-6基因的敲除载体和过表达载体，通过潮霉素筛选分别获得了pon-6基因敲除子和过表达转化子，southern blot鉴定为单拷贝，在CYA平板上形态学分析表明木霉菌pon-6基因敲除子，过表达转化子与野生株T23形态上差别不明显，但耐受敌敌畏的能力过表达转化子明显比野生株T23更强，敲除子最弱。通过研究敲除子和过表达转化子降解敌敌畏的作用发现两者均具有降解敌敌畏的作用，但降解效率过表达转化子比野生株T23要高，敲除子最弱。RT-PCR结果显示pon-6基因随着敌敌畏诱导时间的不同相对表达量有所不同，在同一时间转化子中pon-6基因相对表达量高于野生株，但两者pon-6基因相对表达量变化趋势一致，均为在诱导6 h后达到最大，之后逐渐减弱。RT-qPCR的结果表明pon-6基因相对表达量与半定量结果趋势基本一致。以上结果表明 pon-6基因在木霉菌降解敌敌畏的过程中起了重要的作用。通过研究影响过表达转化子降解敌敌畏的相关因素发现，其降解效率与葡萄糖剂量，初始敌敌畏浓度及pH等因素有关，转化子降解敌敌畏的葡萄糖最佳浓度为1000 ug/mL，最适pH值为8.0，初始浓度为500 ug/mL的敌敌畏时，木霉菌敌敌畏降解效率最高，敌敌畏初始浓度超过1000 ug/mL则会对木霉菌产生毒害而使其降解效率下降。
　　为了明确PON-6蛋白的亚细胞定位，通过构建eGFP与pon-6基因的融合表达载体，确定了PON-6蛋白位于木霉菌的胞内细胞质中，由于前期研究表明，木霉菌胞内敌敌畏降解效率高于胞外，因此推断敌敌畏可能通过某种机制进入胞内后由 PON-6蛋白降解，为下一步研究降解机理提供了重要线索。同时，本研究还通过GC-MS比较分析了木霉菌过表达转化子与野生株T23降解敌敌畏的中间产物，发现两者的代谢产物中均有二氯乙酸，且同一时间过表达转化子中中间产物含量比野生型要高，这也进一步证明了pon-6基因在木霉菌降解敌敌畏中起了重要的作用。
　　为进一步研究pon-6基因与木霉菌中其它耐受或降解敌敌畏相关基因的关系，初步研究了pon-6、cre1和hex1三者的相互关系，结果显示，在cre1敲除子中pon-6基因的相对表达量没有呈现先高后低的变化趋势，而是先低后高；pon-6基因在hex1敲除子中的相对表达量比在T23野生株和突变株中的相对表达量要低，而hex1基因在pon-6过表达转化子中相对表达量最高，其次是野生株T23，敲除转化子最低。以上结果表明木霉菌pon-6，cre1和hex1基因之间存在着关联，即木霉菌降解敌敌畏，木霉菌生长代谢和木霉菌耐受敌敌畏之间的关系，但具体三者是如何作用降解敌敌畏，还有待进一步的研究。
　　综上所述，pon-6基因在木霉菌降解敌敌畏的过程中起了重要的作用。

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作者
元旭;
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作者单位

上海交通大学;

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授予单位上海交通大学;
学科生态学
授予学位硕士
导师姓名陈捷;
年度 2015
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类农用化学物质、有毒化学物质污染及其防治;环境微生物学;
关键词
木霉菌; pon-6基因; 敌敌畏; 降解作用; 同源克隆; 蛋白结构;

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