• 主题
高级搜索  >
历史搜索 清空历史
首页> 中文学位 >实时荧光聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒基因型方法的建立和临床应用
【6h】

实时荧光聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒基因型方法的建立和临床应用

代理获取
页面导航
  • 目录
  • 摘要
  • 著录项
  • 相似文献
  • 相关主题

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分：实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型B～D方法的建立

资料与方法

结果

讨论

第二部分：实时荧光PCR法检测兰州地区乙型肝炎病毒基因型的临床研究

资料与方法

结果

讨论

第三部分：乙型肝炎病毒三种基因分型方法的比较

资料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

附录一：乙型肝炎病毒基因型与变异(综述)

附录二：英文缩写

论文撰写及发表情况

致谢

学位论文原创性声明和版权使用授权书

展开▼

摘要

我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染高发区，乙型病毒性肝炎严重威胁人类的生命健康。HBV基因型的区分为深入研究乙型肝炎的临床特点提供了重要手段。HBV的基因型是长期由病毒突变和宿主的筛选累积形成的结果。目前的研究显示，不同HBV基因型在病毒变异、疾病表现和治疗应答等临床现象方面存在着差异，除了宿主自身的因素之外，病毒基因异质性可能起到一定的作用。为进一步探讨基因型与临床结局的关系，有必要进行更大范围的流行病学调查。HBV基因分型检测可以用于流行病学调查，更好得增强临床用药和治疗方案的针对性，有效遏止HBV流行蔓延。本研究的主旨在于建立一种简便、灵敏、快速、廉价的HBV分型方法，即实时荧光聚合酶链反应(PCR)HBV基因分型法并验证其准确性。运用此方法检测HBV基因型，与其他HBV基因分型法进行比较，并分析HBV的临床意义。 一、实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型B～D方法的建立乙型肝炎病毒具有很高的基因异质性，根据毒株全基因序列的差异可分为A～H8个基因型[1-4]。HBV基因型的分布具有明显的地理学特点[5-7]。在我国，HBV基因型A、B、C和D均有分布，其中B和C为优势基因型，基因型D主要见于少数民族人群，基因型A较为罕见[8-10]。近来很多的研究表明HBV基因型在HBV感染者的临床治疗和疾病预后中起着很重要的作用。由于临床上缺少简便、准确、快速、廉价的HBV基因分型方法，因此难以开展大规模的流行病学调查，无法详细阐明HBV基因型与HBV感染疾病之间的相互影响。基于此目的，结合我国的基因型分布特点，我们设计了B、C、D型的组合引物探针，建立实时荧光PCR检测HBV基因型的方法，并用此法对132例慢性乙型肝炎(CHB)患者的HBV基因型进行了检测。 本研究根据HBV型特异性碱基来检测基因分型。我们在设计型特异性引物时遵循的基本原则是：100bp内至少有6个以上独特的碱基才认为是型特异性碱基聚集区。选择GenBank中已发表的明确分型的143株HBV，应用DNASIS分析软件对全基因序列进行多序列充分比较分析，寻找出B、C、D各型HBVDNA的型特异性碱基聚集区域，根据这些片段设计各型Taqman探针，再根据探针设计引物。运用ABI7000软件对结果进行分析。某一型的探针引物只与相同型的模板结合才发生PCR扩增反应，而且本检测法扩增片段短，采用较高的煺火温度，可以保证扩增的特异性。反应体系经荧光定量PCR仪扩增后即可简便、灵敏、快速地鉴别HBV基因型。结果显示：132例标本中B型检出率为19.7％(26/132)，C型占69.7％(92/132)，D型占7.6％(10/132)，4例未分型，占3％(4/132)。 HBV基因型分型标准的依据是全基因序列同源性≥92％或S基因序列同源性≥96％[11，12]。S基因适于基因分型[13]。我们随机选取B、C、D基因型各3株进行HBVS区扩增，克隆(每株标本各挑取2个克隆，共18株克隆)测序后应用DNASIS分析软件，将HBVS基因测序结果与GenBank中已发表的HBV基因型序列进行同源性比较，确定其基因型。18株HBV克隆标本S基因测序结果与本分型法完全一致。随机选取71例已检测标本和4例未分型标本，应用特异性引物BS1/S1R[14]扩增其S基因，PCR产物纯化后直接测序，测序结果用DNASIS分析软件与GenBank中已发表的HBV基因型序列进行同源性比较，确定基因型。75例实时荧光PCR法检测结果与HBVS基因PCR产物直接测序法检测结果比较，1例不符，4例实时荧光PCR法检测未分型，准确率达93.3％(70/75)。 通过实时荧光PCR法对132例慢性乙型肝炎患者HBV基因型分析，18株不同基因型HBV克隆测序结果以及75例HBVS基因PCR产物直接测序法检测结果比较，证明实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法检测结果与后2种基因序列测定法一致。 实时荧光PCR基因分型法通过HBV型特异性碱基来区分基因型，并根据荧光能量共振原理，把特定荧光的有无及其量的变化与PCR反应同步进行，从而实现封闭式检测，大大减少污染的机会，而且操作简便，分型灵敏度高，成本低廉，准确率高，适用于HBV基因型的大规模临床和流行病学调查。 二、实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型的临床应用由于病毒的基因控制着抗原的表达；不同的毒株出现某些变异的频率不同；不同毒株机体免疫清除抵抗力不同以及其他的因素可能导致了不同基因型具有不同的感染后疾病谱。 我们运用建立的实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法，检测兰州地区128例慢性乙型肝炎患者基因型，同时收集HBVDNA、HBV-M等临床资料，对HBV基因型与疾病临床情况进行了研究分析。研究结果显示：1、兰州地区CHB患者中基因型主要以C型为主，其次为B型及D型；2、男性与女性的HBV基因型构成比无明显差异；3、基因型C的感染者有更高的HBVDNA含量阳性率，HBeAg阳性率明显高于基因型B；4、基因型B感染后致抗HBe阳性率高于基因型C。 三、HBV基因型检测方法的比较随着HBV基因型概念的提出，基因分型技术逐渐得到发展。目前HBV基因分型方法主要有4种：①基因序列测定法[15，16]；②聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)[17，18]；③型特异性引物聚合酶链反应法[19，20]；④单克隆抗体酶联免疫法[21]。四者比较，基因序列测定结果准确，但技术复杂，实验条件要求高，费用昂贵，难以常规使用，不适用于大规模临床和流行病学调查。其他几种方法各有优缺点，其发展也经历了由复杂到简单，由烦琐到快速的过程。据了解，目前国内外传统的临床诊断方法均无法迅速简便地检测HBV基因型，以致于难以全面快速地反映HBV在患者体内的感染状况，在临床上会表现为漏诊、盲目用药和延误治疗。同时，目前一些实验室采用的基因型检测方法由于周期长、手段复杂、费用高，无法做到临床推广。 本研究用HBVS基因测序方法、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法和实时荧光聚合酶链式反应(PCR)方法对75例慢性乙型肝炎病人血清基因型进行检测，对检测结果进行分析比较。HBVS基因测序方法检测出B型14例，C型55例，D型6例；PCR-RFLP方法检测出B型14例，C型52例，D型8例，未分型1例；实时荧光PCR方法检测出B型12例，C型52例，D型7例，未分型4例。PCR-RFLP和实时荧光PCR法检测结果比较分析后显示：两种方法在检出率、灵敏度、特异度等方面无明显差异。HBVS基因序列测定法分型准确可靠，由于其技术复杂、实验流程长、实验条件要求高等原因难以作临床常规使用。PCR-RFLP法与实时荧光PCR法虽然存在某些不足，但都大大简化了基因型的检测步骤，提高了检测的灵敏度和特异度，缩短检测时间，降低检测成本，可作为临床上大批标本的检测工作。 详细的病毒类型的分子信息是很重要的，是临床个体化治疗实现的基础，这就要求我们对HBV基因型进行深入的了解。HBV基因分型的检测有利于对HBV感染的流行病学、病因学和临床诊治进行更加深入细致的研究。随着HBV基因型分型方法的日趋完善，将有助于发现新的HBV基因型及开展流行病学调查，了解HBV各基因型毒力的强弱和致病性的关系，同时也可用于基因型与疗效相关性的研究。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱：kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备：11010802029741号 ICP备案号：京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有

  • 客服微信

  • 服务号