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脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽的筛选及模拟肽对大鼠内毒素性急性肺损伤保护作用的实验研究

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前言

第一部分脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽的筛选

材料与方法

结果

讨论

第二部分脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽的生物活性检测

材料与方法

结果

讨论

第三部分脂多糖结合蛋白与CD14结合位点模拟肽对大鼠内毒素性急性肺损伤保护作用的实验研究

材料与方法

结果

讨论

全文结论

致谢

照片

参考文献

文献综述一 LBP/CD14与急性肺损伤

文献综述二 抗内毒素治疗的研究进展

攻读博士学位期间发表的论文

英文论著

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摘要

背景与目的： 急性肺损伤(ALI)是指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭，临床常见，死亡率高。内毒素是革兰阴性菌壁外膜成分，化学结构为脂多糖(LPS)，是ALI的主要致病因素之一，目前尚无有效的抗内毒素治疗药物。正常情况时人体内LPS的水平很低，即使在革兰阴性菌脓毒血症时，血浆中LPS浓度仅为0.01～1ng/ml，如此低水平LPS的致炎作用需依赖于LBP/CD14的增敏。研究发现，LBP可增强LPS对表达mCD14细胞的刺激作用，当LBP存在时LPS可刺激单核巨噬细胞产生TNF-α增加1000倍。在LPS的致炎过程中，LBP肽链的N末端与LPS结合，C末端与CD14结合。由于LBP/CD14位于LPS致炎信号通路的上游，对LPS有增敏作用，阻断经LBP/CD14的LPS信号传导，可望在各种炎性细胞激活和炎性细胞因子产生之前阻断炎症反应，减轻内毒素性ALI。为此，本研究拟运用噬菌体展示肽库筛选技术，筛选LBP与CD14结合位点的模拟肽，再行体外实验观察模拟肽的抗内毒素生物活性，并观察该模拟肽对大鼠内毒素性ALI的保护作用，以期为内毒素性ALI的防治提供实验依据和新的策略。 方法： 1.采用噬菌体展示肽库筛选技术，对CD14进行包被，以LBP为洗脱液进行亲和筛选。再随机挑取100个筛选后噬菌体克隆，采用ELISA.法逐步进行结合实验、竞争实验和细胞因子生成抑制实验，筛选出与CD14具有高亲和力、与LBP竞争性强的噬菌体克隆，并对筛选阳性噬菌体克隆进行测序，测序所得12肽与LBP一级氨基酸序列进行比对，获得模拟肽。 2.应用FMOC固相法合成模拟肽，采用ELISA法检测模拟肽与CD14的结合活性及与LBP竞争性结合CD14的活力；用LPS诱导U937细胞产生TNF-α，观察模拟肽高(10μg/ml)、中(1.0μg/rml)和低(0.1μg/ml)浓度对LPS诱导细胞表达TNF-α mRNA和生成TNF-α的影响，并进一步观察不同时间应用模拟肽对LPS诱导细胞表达TNF-αmRNA和生成TNF-α的作用。 3.采用颈静脉注射LPS的方法复制大鼠内毒素性ALI模型，按随机原则将实验大鼠分为正常对照组(N)、脂多糖致伤组(LPS)和模拟肽治疗组(MP12)。大鼠按分组进行不同处理，2h后，测定动脉血氧分压(PaO2)和肺组织湿干重比(W/D)，采用伊文思蓝示踪法检测肺微血管通透性，并进行肺组织病理形态学观察；再行支气管肺泡灌洗分离肺泡巨噬细胞，观察模拟肽对肺泡巨噬细胞结合LPS的影响。 结果： 1.噬菌体展示肽库的亲和筛选使噬菌体得到了有效富集，结合实验显示100个噬菌体克隆中73个与CD14有较高的结合活性，竞争抑制实验表明26个克隆具有较强与LBP竞争结合CD14的活性；细胞因子生成抑制实验显示，26个噬菌体克隆中8个可显著抑制LPS诱导细胞生成TNF-α。 2.对8个筛选阳性的噬菌体克隆进行测序，获得3条12肽序列FHRWPTWPLPSP，AAFHRAHHLTSP和MHRHPPPITLPL，其核心序列为共同序列FHRXPXXXXPXX，Blast检测3条多肽与LBP一级结构无相似的序列，为模拟肽； 3.应用FMOC固相合成法成功合成模拟肽AC-FHRWPTWPLPSP-NH2，纯度在95％以上，分子量为1562.00，与理论值相符。结合实验显示，模拟肽在高、中浓度时与CD14有较高的结合活性；竞争抑制实验显示，模拟肽在高、中浓度时有较强的与LBP竞争结合CD14的活力。 4.LPS组细胞TNF-α基因和蛋白表达较对照组显著增高(P＜0.01)，模拟肽高、中浓度组TNF-α比LPS组明显降低(P＜0.05)；不同时间应用模拟肽对LPS诱导细胞TNF-α影响实验结果显示，早期应用模拟肽干预可抑制LPS诱导细胞TNF-α的表达。 5.与正常对照组比较，LPS致伤组大鼠的PaO2下降、W/D比值增大、肺微血管通透性增强和肺泡巨噬细胞平均荧光强度增加(P＜0.05)；模拟肽治疗组上述指标较LPS组有明显改善(P＜0.05)。 结论： 1.本研究成功的从噬菌体展示肽库中筛选获得了与CD14有高亲和力、抑制LBP结合CD14活性强、可明显降低LPS诱导细胞生成TNF-α的噬菌体克隆。 2.测序获得了噬菌体克隆展示肽序列FHRWPTWPLPSP、AAFHRAHHLTSP和MHRHPPPITLPL，其核心序列为FHRXPXXXXPXX，多肽与LBP一级结构无相似的序列，为模拟肽。 3.模拟肽AC-FHRWPTWPLPSP-NH2具有与CD14亲和力高，抑制LBP结合CD14活性强的生物特性。 4.模拟肽能够在基因和蛋白水平抑制LPS诱导单核巨噬细胞TNF-α的表达，其早期应用对TNF-α的抑制作用明显。 5.模拟肽可改善内毒素性ALI大鼠的氧合，减轻肺损伤，其减少大鼠肺泡巨噬细胞与LPS的结合可能是对大鼠内毒素性ALI保护作用的机制之一。

著录项

  • 作者

    冯起甲;

  • 作者单位

    第三军医大学;

  • 授予单位 第三军医大学;
  • 学科 内科学(呼吸系病)
  • 授予学位 博士
  • 导师姓名 吴国明;
  • 年度 2008
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 肺疾病;
  • 关键词

    急性肺损伤; 内毒素; LPS; 模拟肽;

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