泛耐药铜绿假单胞菌整合子-金属酶基因整合模型的构建和亚胺培南对整合效率的影响

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研究背景：
　　铜绿假单胞菌是院内获得性感染的重要条件致病菌，可造成一定程度的院内感染流行。近十多年来PA在所有院内感染的革兰阴性菌中排第1位[1]。近年来出现了对除了粘菌素外的所有抗假单胞的抗生素同时耐药的铜绿假单胞菌,称为泛耐药铜绿假单胞菌（Pan-drug resistant Pseudomonas aeruginosa,PDRPA）[2]。PDRPA菌株可以通过整合子在细菌间,甚至跨越菌属的界限横向传播耐药基因[3]，并且具有高效性和快速性[4]。世界各地均出现了PDRPA暴发流行的报道[5-7]。近年来研究显示 PDRPA的广泛耐药性与金属酶（金属β-内酰酶 metallo-beta-lactamase，MBL）的出现有着密切的关系[8]。金属酶是一类活性位点有金属离子的β-内酰酶，能够有效水解除单环类抗菌药物外的几乎所有β内酰类包括碳青霉烯类抗生素[9]。
　　细菌在抗生素的选择压力下，可以通过其耐药基因的水平转移，获得的外源性耐药基因从而会加快临床耐药菌株的产生与播散。整合子通过位点特异性重组捕获外源基因盒并使耐药基因表达，同时整合子位于质粒上可参与转移，使耐药基因发生播散。目前在整合子中发现的基因盒大部分是耐药基因盒，都可编码对几乎临床常用抗菌药种类产生耐药性[10]。整合子因其在细菌耐药基因水平转移中的重要作用而受到研究者的关注。
　　对整合子的深入研究将是PDRPA耐药性研究的一个突破口,整合子捕获金属酶基因盒具有定向和定点的特点，可以将整合子-金属酶系统研发成一种基因重组的工具。PDRPA的广泛耐药性如何获得？其调控机制如何？目前尚不清楚。本课题组前期研究表明，造成我院PDRPA医院获得性肺炎暴发流行的泛耐药铜绿假单胞菌广泛耐药性主要与IMP-1型金属酶有关，为I类整合子携带，提示整合子-金属酶耐药基因盒在PDRPA的广泛耐药及其传播中起着重要的作用。本项目拟在前期研究基础上利用分子克隆、实时定量 PCR建立整合子-金属酶基因整合模型/整合频率测定系统模型，观察抗生素选择压力对金属酶整合的影响，为监控PDRPA医院获得性肺炎及寻求新型的抗菌药物提供基础。
　　目的：
　　建立泛耐药铜绿假单胞菌整合子-金属酶基因整合模型/整合频率测定系统模型，检测不同浓度亚胺培南是否能影响整合效率。为下一步实验研究进展和防控泛耐药铜绿假单胞菌下呼吸道感染以及研发新型抗菌药物提供基础。
　　方法：
　　1.建立测定泛耐药铜绿假单胞菌整合子捕获金属酶基因效率的方法:
　　（1）筛选鉴定出符合要求的泛耐药铜绿假单胞菌，以整合子阳性但金属酶阴性的铜绿假单胞菌DNA为模板PCR扩增整合子基因及整合酶基因，同样以PDRPA菌株DNA为模板PCR扩增IMP-1型金属酶基因；
　　（2）以质粒 pAK1900为载体构建克隆高表达整合酶的重组质粒 pAK-INT和以质粒pDSK519为载体构建克隆同时含有整合子基因和金属酶基因的重组质粒pDSK-INMBL；
　　（3）观察整合子在铜绿假单胞菌中整合金属酶基因的整合反应；先将pAK-INT转化至大肠杆菌BL21中，再将pDSK-INMBL转化。制备成含有pDSK-INMBL和pAK-INT重组质粒的大肠杆菌及只含pDSK-INMBL重组质粒的大肠杆菌，表型筛选法观察其整合反应。
　　（4）重组质粒转化大肠杆菌BL21过夜培养后实时荧光定量PCR观察整合反应，定量PCR分别检测整合子总拷贝数及发生整合反应的整合子拷贝数（PCR产物长度不同），MBL基因在aatI位点发生整合作用的拷贝数除以整合子的总拷贝数则为整合频率。设计引物P7及P8用于测定整合子总拷贝数，引物P9和P10用于测定MBL基因盒在aatI位点发生整合作用的整合子的拷贝数。制备其标准曲线并对整合频率进行计算测定，从而建立整合子-金属酶基因整合模型/金属酶基因整合频率测定系统。
　　2.测定不同抗生素浓度对于整合子捕获金属酶基因整合效率的影响:
　　（1）分子克隆构建重组质粒pAK-INT和pDSK-INMBL；
　　（2）将两种重组质粒转化感大肠杆菌 BL21，不同浓度亚胺培南与其共培养，利用金属酶基因整合频率测定系统对整合子及整合金属酶基因阳性菌株的拷贝数进行测定，观察不同浓度亚胺培南对金属酶基因整合的影响；
　　（3）Western-blot分析金属酶蛋白表达在整合子中蛋白水平的表达；
　　结果：
　　1.分离的18株PDRPA菌株中，采用E-Test试条检测发现金属酶阳性的PDRPA菌株有7株,金属酶阴性的PDRPA菌株有11株。
　　2.重组质粒pAK-INT和重组质粒pDSK-INMBL转化大肠杆菌BL21观察整合反应：只含有pDSK-INMBL质粒的大肠杆菌BL2l在亚胺培南平板上出现少数并且较小的菌落，没有整合酶的表达下，得不到效的生长，对亚胺培南较敏感。在大肠杆菌BL2l中同时含有重组质粒pAK-INT及pDSK-INMBL时，在亚胺培南平板上出现较多的大菌落，在高表达整合酶的情况下，金属酶基因被整合子捕获而获得了启动子，有了金属酶进而产生了耐药性，从而菌落生长较好。
　　3.在有高表达整合酶的情况下，含有重组质粒pAK-INT和pDSK-INMBL大肠杆菌 BL21的整合频率为2.09*10-4，在没有整合酶高表达的情况下含有重组质粒pDSK-INMBL大肠杆菌 BL21的整合频率低于<4.28*10-8。
　　4.添加不同浓度的亚胺培南对泛耐药铜绿假单胞菌整合子-金属酶基因整合作用的效率的有一定影响，抗生素选择压力可影响泛耐药铜绿假单胞菌整合子整合金属酶的整合频率。
　　5.Western免疫印迹证实金属酶蛋白在整合子attl位点的表达水平，金属酶蛋白表达量大约是其在原始位置表达水平的6倍。
　　结论：
　　1.成功构建了含有泛耐药铜绿假单胞菌整合酶基因的重组质粒 pAK-INT和含有泛耐药铜绿假单胞菌整合子基因以及IMP-1型金属酶基因的重组质粒pDSK-INMBL。
　　2.建立了测定泛耐药铜绿假单胞菌整合子捕获金属酶基因效率的方法。
　　3.发现高浓度的抗生素能促进金属酶在整合子的attl位点重组频率，进而提高相应的表达水平。

著录项

作者
饶志刚;
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作者单位

广州医科大学;

广州医学院;

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授予单位广州医科大学;广州医学院;
学科呼吸内科学
授予学位硕士
导师姓名赵子文;
年度 2012
页码
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R378.991;
关键词
铜绿假单胞菌; 金属酶基因; 模型构建; 亚胺培南; 整合效率;

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1. 耐亚胺培南的铜绿假单胞菌整合子基因研究 [J] . 肖增璜 ,石磊 ,彭毅 . 中国抗生素杂志 . 2008,第003期
2. 耐亚胺培南铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子遗传标记及β-内酰胺类抗生素耐药相关基因研究 [J] . 仵蕾 ,沈娟 ,黄支密 . 实验与检验医学 . 2006,第006期
3. 不同地区铜绿假单胞菌第一类整合子和整合子相关基因盒的分布 [J] . 杨维青 ,石磊 ,尹晓琳 . 中国抗生素杂志 . 2006,第001期
4. 产金属酶铜绿假单胞菌携带Ⅰ类整合子的研究 [J] . 程曦 ,杜宝中 ,范红 . 南方医科大学学报 . 2007,第006期
5. 整合子与金属酶介导的铜绿假单胞菌耐药性研究进展 [J] . 李艳 ,刘长庭 . 解放军医学院学报 . 2005,第002期
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7. 耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药机制与金属酶、整合子的关系研究 [A] . 程曦 . 2007

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