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【6h】

利用肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体条件性敲除基因

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1 绪 论

1.1研究背景

1.2诱导型RNAi研究现状

1.3本文研究的目的及意义

1.4本文研究内容

2 细胞的培养和观察

2.1 引言

2.2 细胞培养材料和设备

2.3 细胞培养准备工作

2.4 细胞培养方法

2.5 细胞形态观察

2.6 本章小结

3 选取合适的热休克元件和肿瘤特异性启动子

3.1引言

3.2 实验方法

3.3 结果分析与讨论

4 构建含肿瘤特异性启动子的质粒phTERTp-EGFP和phTERT/HSEp-EGFP

4.1引言

4.2 实验材料和仪器

4.3 实验准备工作

4.4 实验方法

4.5 实验结果

4.6结果分析与讨论

5 鉴定phTERTp-EGFP和phTERT/HSEp-EGFP质粒的表达能力

5.1 引言

5.2 实验材料和仪器

5.3 实验方法

5.4实验结果

5.5结果分析与讨论

6 构建可表达siRNA的质粒pMhTERTpsiRNA和pMhTERT/HSEpsiRNA

6.1引言

6.2 实验材料和仪器.

6.3 实验准备工作

6.4 实验方法

6.5 实验结果

6.6结果分析与讨论

7 检测可调控型siRNA表达载体对SNCG基因的敲除效果

7.1引言

7.2 实验材料和仪器

7.3 实验方法

7.4实验结果

7.6 结果分析与讨论

8 结论与展望

8.1 本研究主要结论

8.2 后续工作展望

致谢

参考文献

附录 作者在攻读硕士学位期间发表论文目录

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摘要

RNAi是在生物进化上高度保守的特异性转录后基因沉默过程，并已经成为强大的基因操作工具。它几乎可以用来研究任何一种基因的分子途径以及表型和基因型之间的关系。但仍存在些许不足之处，严重限制了RNAi在基因治疗领域中的广泛应用。其中RNAi在时间和空间上的不可控性以及非靶向性是需要亟待解决的难题。诱导型RNAi技术可以通过诱导物介导shRNA的表达进而实现对靶基因的有效调控。与诱导型调控系统结合的RNAi体系作用机制更精细，这可能会开辟出一个更广阔的应用领域。本研究选取合适的热休克元件和肿瘤特异性启动子，将两者有效结合，构建一种温度诱导型的RNAi质粒载体。具体实验内容和结果如下：
　　①选择hTERT肿瘤特异性启动子的核心序列，它几乎只在大多数的癌症细胞中启动表达。热休克蛋白启动子中含有可以响应热的热休克元件，实验中选择三种热休克元件：一种来源于小HSP家族的Hsp27；另一种是三个“NGAAN-NTTC”HSE基本单位的重复排列；最后一种是由“AGAAC”和“GTTCT”交替排列得到的HSE序列。将HSE序列可以插入到hTERT启动子序列-65和-85位点之间或者放在首位。
　　②构建phTERTp-EGFP、phTERT/HSE（AB）p-EGFP、phTERT/HSE（MN）p-EGFP和phTERT/HSE（XY）p-EGFP四种质粒，并将其转染至MCF-7细胞中，通过检测EGFP的蛋白表达量比较不同启动子的启动能力。数据显示hTERT/HSE（MN）和hTERT/HSE（XY）启动子既可以降低hTERT启动子的本底表达水平又可以很好的响应过高热。此外，这两种启动子在HaCaT和HL7702人正常细胞中表达EGFP的量远远低于Hsp70启动子，这表明所构建的phTERTp-EGFP和phTERT/HSEp-EGFP质粒具有良好的肿瘤特异性。
　　③构建pMhTERTpsiSNCG和pMhTERT/HSEpsiSNCG质粒载体，并选择MCF-7和HepG2为实验细胞，以SNCG为靶基因，分别从RNA和蛋白水平上检测这种表达系统的敲除效果。实验结果显示无论是在MCF-7还是在HepG2细胞中，pMhTERT/HSE（MN）psiSNCG和pMhTERT/HSE（XY）psiSNCG质粒在37℃条件下几乎不能敲除SNCG，而当经历过热诱导，这两种质粒沉默SNCG基因的能力明显提高，敲除率分别在50％和60%以上。

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