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纳秒电脉冲致人卵巢癌细胞及其顺铂耐药株DNA损伤时间效应

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前言

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂及试剂配制

1.1.2仪器

1.1.3细胞系

1.2方法

1.2.1细胞培养

1.2.2 nsEP处理

1.2.3 WST-8 法检测细胞死亡率

1.2.4 单细胞凝胶电泳实验

1.3统计学方法

2结果

2.1细胞生存率

2.2细胞死亡率与彗星形成率

2.3 TL，TM和OTM

3讨论

全文结论

参考文献

文献综述: DNA损伤修复与卵巢癌顺铂耐药机制研究进展

致谢

攻读硕士期间发表的论文及科研项目

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摘要

卵巢癌是女性生殖器常见恶性肿瘤之一，由于早期缺乏典型症状，且筛查手段有限，故诊断十分困难，就诊时大多已发展为晚期，但晚期疗效又不理想。虽然卵巢癌的发病率居妇科恶性肿瘤的第三位，低于宫颈癌和子宫内膜癌，但其死亡率却位于妇科恶性肿瘤的首位。尽管已有多种治疗手段应用于临床，但其5年生存率仍较低。顺铂是临床治疗多种肿瘤重要的化疗试剂，它的主要作用靶点是DNA。放、化疗均通过损伤肿瘤细胞DNA来达到治疗目的，治疗过程中肿瘤细胞将逐渐产生抗性，导致治疗失败。纳秒电脉冲（nanosecond electric pulses, nsEP）是一种很有潜力的治疗方法，它可跨膜影响细胞内结构，能够诱导细胞凋亡、抑制血管生成以及破坏肿瘤微环境等，从而导致肿瘤细胞坏死。nsEP作为一种不需要药物的纯电场治疗，且无热消融，有望成为肿瘤治疗的一种新型手段。
　　目的：本研究旨在通过研究nsEP对人卵巢癌顺铂敏感和耐药细胞株DNA损伤的时间效应，探讨nsEP引起的DNA损伤与细胞死亡之间的相关性。
　　方法：取对数生长期的A2780细胞或者C30细胞制备密度为5×105/ml的单细胞悬液，将细胞置于漩涡混匀器上面混匀后取1ml细胞于24孔板中，每次脉冲处理时每一个24孔板只有一个孔中盛有细胞。然后调整电极间距离为1 cm，电压6 kV（即场强为6 kV/cm），脉宽为24 ns的脉冲电场处理60 s。对照组细胞给予假脉冲处理。每个时间点均设有实验组和对照组。
　　1，脉冲处理完毕后，将24孔板中所有的细胞回收到EP管中再次混匀以后用于后续实验。nsEP处理后继续培养细胞于0 h、4 h、8 h、12 h和24 h用CCK-8试剂盒测定细胞活性，并计算细胞死亡率。每个时间点均设置有实验组（nsEP处理后）、对照组（nsEP假处理）和空白对照组（不含细胞，仅加入100μl实验用培养基）。
　　2，nsEP处理后4 h、8 h、12 h、24 h，采用碱性单细胞凝胶电泳实验（彗星实验）检测细胞DNA损伤。利用CASP软件测定对照组尾DNA的95th百分位数设置为彗星形成的阈值。并测量实验组75th百分位数尾长(Tail Length, TL)，尾矩(Tail Moment, TM，尾部DNA％×尾长)和Olive尾矩(Olive Tail Moment, OTM，尾部DNA%×尾矩长)，并计算彗星形成率（%）。
　　结果：
　　1，nsEP处理后0-8 h，C30和A2780细胞的生存率逐渐降低，8-24 h逐渐上升，8 h时细胞生存率最低（P＜0.05）：4h（86.46%vs76.29%），8h（78.52% vs65.96%），12h（84.28% vs75.29%），24h（85.11% vs80.87%）。C30细胞的生存率高于A2780细胞（P＜0.05）。
　　2，从单细胞凝胶电泳结果图可明显看出对照组中 A2780和 C30细胞均未见彗尾出现。在4h、8h、12h和24h的彗星图像中，A2780细胞的尾长均分别比C30细胞的长。这在某种程度上说明了A2780细胞更易受到nsEP的作用而受到损伤。A2780细胞的死亡率与彗星形成率在4-24 h均高于C30细胞。这又从另一方面证实了A2780的敏感性。统计学分析显示，A2780和C30细胞的死亡率均与彗星形成率呈正相关（ r=0.997， P＜0.05；r=0.998，P＜0.05）。这说明细胞的死亡与DNA损伤具有相关性。
　　3，A2780和C30细胞的TL、TM、OTM和其75 th百分位数均随时间变化而变化，最大值出现于8 h。这说明细胞的损伤于8h时达到了一个高峰，随后的转折有可能是DNA损伤修复机制的启动所致。A2780的TL，TM和OTM均高于C30（P＜0.05）。
　　结论： nsEP对顺铂敏感和耐药卵巢癌细胞的DNA损伤具有时间效应；nsEP对人卵巢癌顺铂敏感细胞株和耐药细胞株的 DNA损伤效应存在差异，nsEP对顺铂敏感细胞株的损伤高于耐药细胞株；nsEP所致细胞死亡与DNA损伤有关。

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