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血液和尿液中Ets的高效液相串联质谱检测及其在法医学中的应用

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摘要

第一部分 生物检材中乙醇代谢物硫酸乙酯的高效液相色谱串联质谱检测

1 前言

2 实验部分

2．1 试剂

2．2 仪器设备

2．3 标准工作液的配置

2．4 样本预处理

2．5 高效液相串联质谱仪检测

3、结果与讨论

3．1 条件优化

3．2 质谱图的确认

3．3 方法学评价

参考文献

第二部分 关于血液和尿液中硫酸乙酯的代谢动力学研究

1 前言

2 实验部分

2．1 仪器与试剂

2．2 研究对象

2．3 样本采集

2．4 样本处理

2．5 血液和尿液中Ets的测定

2．6 血液和尿液中乙醇的测定

2．7 尿液中肌酐的测定

2．8 统计方法

3 结果

3．1 血液中的乙醇和硫酸乙酯

3．2 尿液中的乙醇和硫酸乙酯

3．3 相关性

4 讨论

参考文献

文献综述 酒精生物标志物的检测以及其应用

致谢

攻读博士学位期间发表和待发的论文

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摘要

目的:
　　酒精成为“马路杀手”是全球共同面对的一个社会难题，大约50％至60％的交通事故与酒后驾车有关，洒后驾驶已成为车祸致死的首要原因。目前主要采用检测血液中乙醇予以认定酒后驾车，但由于乙醇在体内代谢较快.一般饮酒后6～8 h体内已检测不到乙醇，特别是在酒后驾车肇事逃逸案件中，抽血与事故发生时间间隔过长，血液中往往测不出乙醇成分。可见现行方法，根据血液中乙醇含量来判断事发时间及当事人饮用酒精量时存在诸多不足。Ets是乙醇非氧化代谢途径的直接代谢产物，是乙醇在磺基转移酶的作用下由硫酸盐活化而来。饮酒后8小时Ets仍可以在血液中检测到，3-5天仍然可以在尿液中检测到，因此Ets可以作为乙醇代谢的标志物用于法医学鉴定中判定酒驾。本实验建立高效液相串联质谱法检测血液和尿液中硫酸乙酯的方法，运用该方法测定受试者血液和尿液中的硫酸乙酯，从而了解硫酸乙酯的代谢动力学，并将其运用于法医学中判定酒后驾驶。
　　方法:
　　1、将D5-EtS内标工作液和乙腈（甲醇）加入空白人血液（尿液），经涡旋、离心，取上清液后用40℃水浴氮气吹干，以甲醇（含0.1％甲酸）复溶后离心，取上清液进样分析。
　　2、用高效液相色谱质谱测定血液和尿液中EtS。色谱条件:色谱柱:BOSTON-C18柱(100 mm×2.1 mmID，dp3μm);流动相:乙腈(A)-水(B)（含0.1％甲酸），梯度洗脱;流速:0.2 mL·min-1;柱温:40℃;进样体积:5μL。质谱条件:离子源为ESI源;采用负离子模式质谱检测，在选择离子监测模式下进行定性，并采用内标法进行定量。
　　3、7名志愿者禁酒一周后，按照0.60±0.07g/kg饮用酒精，在一定的时间间隔内每位志愿者收集12份血液标本、10份尿液标本，用液相色谱串联质谱测定血液和尿液中的Ets浓度;用气相色谱-火焰离子化检测器检测相应血液和尿液中的乙醇浓度;用Modular DDPP全自动生化分析仪测定尿中的肌酐浓度。
　　结果:
　　1、尿液中EtS在10.96～10960ng/mL范围内线性关系良好，线性回归方程:Y=0.0008X+0.3329(r=0.989)，最低检出限为0.1 ng/mL，平均回收率为89.6％～117.4％，相对标准偏差为2.8％～10.2％;血液中EtS在5.48～10960ng/mL范围内线性关系良好;线性回归方程Y=0.001X+0.251(r=0.993)，最低检出限(LOD)为0.1ng/mL，平均回收率为80.4％～114.0％之间，相对标准偏差为1.4％～8.72％。
　　2、在消耗0.60±0.07g/kg酒精后，血液中乙醇的最高浓度为66.5±12.8 mg/100ml，血液中EtS的最高浓度为79.9±12.3ng/ml;血液中乙醇达到最高浓度的时间为0.86±0.24h，血液中EtS达到最高浓度的时间为3.36h±0.56h;血液中乙醇的最长检测时间为5.71±0.95h;最后一次采血(8h)均可在血液中检测到EtS;在血液中乙醇浓度(mg/100ml)与EtS浓度(ng/ml)之比大于1的时间在开始喝酒的3h内(范围在2-3.5h)，随后乙醇浓度与EtS浓度之比小于1。在尿液中，乙醇的最高浓度为193.1±26.2mg/100ml，EtS的最高浓度为6882.8±1095.0ng/ml;乙醇达到最高浓度的时间均为4h，EtS达到最高浓度的时间为4.57±0.98h;尿液中乙醇的最长检测时间为13.9±0.6h，尿液中EtS的最长检测时间为37.7±5.5h。在血液中，乙醇的最高浓度与乙醇的曲线下面积之间存在相关性（相关系数为0.723，P＜0.05），乙醇的最高浓度与EtS的曲线下面积之间存在相关性(相关系数为0.714，P＜0.05);EtS的最高浓度与乙醇的曲线下面积之间存在相关性(相关系数为0.79，P＜0.05);EtS的最高浓度与EtS的曲线下面积之间存在相关性(相关系数为0.756，P＜0.05)，在血液中，乙醇的最高浓度与EtS的最高浓度之间存在相关性(相关系数为0.684，P＜0.05)。
　　结论:
　　1、建立了测定血液和尿液中Ets的高效液相串联质谱方法，样本前处理简单方便、稳定性好、灵敏度高、具有较高的回收率和精密度，可应用于法医学中血液和尿液标本中Ets的检测。
　　2、通过对血液和尿液中酒精和EtS的吸收、分布、清除的代谢动力学的研究，表明血液中的EtS的含量可以用来作为饮酒时间的估计，在连续的血液样本中检测到EtS升高以及血液中乙醇和EtS浓度比大于1，均预示近期的饮酒（3.5h内），这是对用血液中乙醇浓度估计饮酒时间的传统方法的一个较大的补充，可用于法医学中酒驾的认定，为法庭科学提供证据。

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