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5-氟尿嘧啶诱导A549细胞凋亡细胞内外药物定量分析及蛋白质组学研究

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摘要

目的:恶性肿瘤是目前危害人们身体健康的最主要疾病,其中由肺癌引起死亡率近年大幅上升。非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)占所有肺癌病例的80％-85%,80%的肺癌患者在诊断后生存率很低。5.氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)为临床常用抗癌药物,耐药性越来越严重,因此有必要对其耐药机制与抗癌机制进行深入研究,为此,本课题拟进行以下研究:
　　 5-FU抑制A549细胞增殖实验、细胞核形态变化观察、流式细胞术检测细胞凋亡,建立A549细胞凋亡模型;HPLC研究5-FU诱导A549细胞时细胞内外药物浓度变化,初步探索该细胞对5-FU耐药性:再运用比较蛋白质组学方法研究5-FU诱导A549细胞凋亡前后蛋白质变化,为探索5-FU对A549细胞抗癌和耐药机制,增强其临床效果提供初步基础。
　　 方法:1、建立了5-FU诱导A549凋亡的模型。MTT法检测5-FU对A549细胞的生长抑制效应,流式细胞仪检测细胞凋亡,DAPI染色法观察药物作用前后细胞核的形态学变化。
　　 2、建立了细胞内外5-FU的HPLC定量分析方法。细胞经药物作用后分别收集细胞内外液,然后通过HPLC来进行定量分析。HPLC分析色谱条件是:色谱柱为Hypersil ODS(4.6 mm×250 mm,5μm):流动相为甲醇-水=2:98(V/V);流速为0.8 ml/min;柱温是30℃;检测波长为265 nm;进样量5μl。
　　 3、研究了5-FU诱导A549细胞凋亡时蛋白质组差异表达变化。分别提取对照组细胞和5-FU处理组细胞总蛋白质,双向凝胶电泳技术(2-DE)分离蛋白质,银染染色,PDQuest8.0软件分析识别差异表达蛋白质,胰酶酶解差异蛋白,基质辅助激光解吸离子飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析酶解的肽段,获得肽指纹图谱(PMF),以肽段质量在Mascot数据库中进行生物信息学分析,以搜索可能的差异蛋白。
　　 结果:1、各处理组(40、80、150μg/ml)细胞出现凋亡:24、48h作用时间内,5-FU浓度为10-100μg/ml时,A549细胞生长的抑制率呈浓度依赖性,在100-300μg/ml范围内试验组的细胞生长抑制率缓慢增加;在10-300μg/ml作用72 h,抑制率未见明显增加;相同浓度作用下,24、48h抑制率增加明显,48、72 h抑制率增加较小;各试验组与对照组差异显著;24、48、72 h的IC50分别为153.20、50.97、14.66μg/ml;细胞凋亡率随药物浓度逐渐增加,与MTT结果基本一致。
　　 2、细胞内液中5-FU在0.1～50.0μg/ml范围内线性关系良好(r=0.9996),平均回收率为97.65%,RSD为0.40%,日内和日间精密度分别为1.30%,1.04%;细胞外液中5-FU在1.0～250.0μg/ml范围内线性关系良好(r=0.9999),平均回收率为102.34%,RSD为2.11%,日内和日问精密度分别为1.32%,1.06%。5-FU达到50μg/ml时A549细胞对5-FU产生一定耐药性,细胞对药物的代谢可能影响细胞内外的药物浓度变化。
　　 3、双向电泳后得到的凝胶图经PDQuest8.0软件分析后,检测到的蛋白点约1100个,MALDI-TOF-MS分析,MASCOT搜索后,鉴定出6个有统计学意义的蛋白点(p＜0.05),其中上调的5种蛋白为:钙网蛋白Calreticulin、应激蛋白Hsp70、Prohibitin、磷酸甘油酸激酶PGK、Cytochrome C;下调的1种为蛋白:Actin。
　　 结论:5-FU能够抑制A549细胞增殖和诱导凋亡,HPLC分析了细胞内外药物浓度的变化,初步探讨了5-FU在细胞内的动态变化,随浓度(大于50μg/ml)增高或作用时间超过48 h,细胞产生耐药性。鉴定的6个蛋白可能作为5-FU诱导A549细胞的作用靶点,Hsp70可能作为其耐药标志物。

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