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诺帝对HPV16亚基因永生化人宫颈上皮细胞的作用

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第一部分：诺帝对HPV-16亚基因永生化人宫颈上皮细胞增殖，凋亡和分化的影响

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

第二部分：诺帝对永生化人宫颈上皮细胞HPV16E6基因抑制作用的初步研究

前言

1材料和方法

2结果

3讨论

全文小结

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参考文献

文献综述：去甲二氢愈创木酸抗肿瘤作用的研究

致谢

攻读学位期间发表和待发表的学术论文

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摘要

第一部分 目的：研究诺帝(Nordy)对HPV16型亚基因(E6、E7)永生化人宫颈上皮细胞(H8细胞)增殖，分化和凋亡的影响作用及机制。 方法：MTT法检测诺帝对H8细胞增殖的抑制作用；免疫细胞化学SP法检测微小染色体维持蛋白(minichromosome maintenance MCM)mcm5的表达；流式细胞术(FCM)和Annexin V-FITC法分析细胞周期和凋亡；光镜、电镜观察细胞形态变化。 结果：①10umol/L、50umol/L、75 umol/L和100umol/L浓度的诺帝能够不同程度地抑制H8细胞增殖，且这种抑制作用呈剂量-时间依赖方式。②免疫细胞化学显示经100umol/L诺帝处理72h后，H8细胞核内mcm5蛋白表达明显减弱。③FCM结果显示：10 umol/L、50 umol/L、75 umol/L、100 umol/L的诺帝处理H8细胞72h后，与对照组相比，G0/G1期细胞数明显增加，S期和G2/M期细胞数明显减少，并呈浓度依赖性，诺帝作用后H8细胞的增殖明显受到抑制，细胞被阻滞在G0/G1期。用100 umol/L和200umol/L诺帝处理H8细胞48h后，用Annexin V-FIIC法分析，结果显示实验组细胞凋亡率(分别为12.322±0.786％和24.330±3.228％)明显高于对照组细胞的凋亡率(3.478±1.519％)，差异具有显著性，这提示一定浓度的诺帝可以促进H8细胞凋亡的发生。④光镜下观察，诺帝作用H8细胞后，可见细胞体积变小且较规则，核分裂像明显减少，核/质比例下降。电镜观察细胞核变小变规则，异染色质增多，核逐渐成熟，成熟的线粒体，内质网等细胞器增多，细胞形态朝良性方向分化。同时细胞凋亡增多，出现明显的凋亡小体。 结论：诺帝具有抑制H8细胞增殖，促进凋亡，诱导其分化作用，这种作用可能是通过诺帝抑制H8细胞在S期进行DNA合成，使细胞增殖受阻于G<,0>/G<,1>期，同时降低mcm5蛋白活性的表达来实现的。 第二部分 目的：研究诺帝(Nordy)对永生化人宫颈上皮细胞(H8细胞)HPV16 E6基因的抑制作用和机制。 方法：免疫细胞化学SP法检测诺帝作用前后H8细胞E6蛋白和P53蛋白表达；RT-PCR检测诺帝作用前后HPV16E6 mRNA的表达情况。 结果：①免疫细胞化学显示，E6和P53蛋白在对照组细胞内呈阳性表达，阳性物分别位于胞浆和胞核，经100umol/L诺帝处理72h后，H8细胞E6蛋白和P53蛋白表达明显减弱，与对照组相比，差异有显著性。②用浓度10umol/L、50umol/L、100umol/L、200umol/L诺帝处理H8细胞72小时后，浓度为10umol/L的诺帝作用后H8细胞的HPV 16E6 mRNA的表达量与对照组的表达量无明显差异，而较高浓度的诺帝(50umol/L，100umol/L，200umol/L)处理H8细胞72小时后H8细胞的HPV16E6 mRNA的表达量相比对照组有明显降低，差异具有统计学意义(p<0.05)。 结论：诺帝具有一定抑制HPV16病毒的作用，主要表现在抑制HPV16E6基因的mRNA的表达，进而影响E6基因的转录，导致病毒E6蛋白和P53蛋白表达降低。

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