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枯草芽孢杆菌LD-8547溶栓酶溶栓效果初步研究

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1 文献综述

引言

1.1 血栓病研究现状

1.1.1 血栓形成机制

1.1.2 溶栓药剂研究进展

1.2 豆豉溶栓酶的研究现状

1.2.1 菌种选育

1.2.2 理化特性

1.2.3 酶活测定方法

1.2.4 基因工程研究

1.2.5 体内外溶栓应用

1.3 本实验研究意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株

2.1.2 实验动物

2.1.3 培养基及试剂配制

2.1.4 试剂

2.1.5 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 菌种活化与扩大培养

2.2.2 枯草芽孢杆菌的液体发酵

2.2.3 溶栓酶的分离纯化

2.2.4 酶活测定

2.2.5 蛋白浓度测定

2.2.6 优球蛋白凝块溶解试验

2.2.7 溶栓酶口服急性毒性试验

2.2.8 小鼠尾部血栓预防试验

2.2.9 小鼠体内出血及凝血试验

2.2.10全血凝块及全血浆凝块溶解试验

2.2.11兔颈动脉血栓溶解试验

2.2.12溶栓酶血药浓度的初步测定

3 结果与分析

3.1 豆豉溶栓酶的分离纯化

3.2 溶栓酶标准曲线制备及活性测定

3.3 蛋白标准曲线制备及蛋白含量测定

3.4 溶栓酶对优球蛋白凝块的溶解作用

3.5 溶栓酶对小鼠急性毒性作用

3.6 溶栓酶对小鼠尾部血栓的影响

3.7 溶栓酶对小鼠体内出血、凝血时间的影响

3.8 溶栓酶对小鼠全血块、全血浆凝块溶解的影响

3.9 溶栓酶对颈动脉血栓的溶解作用

3.10 血药浓度的初步研究

4 讨论

4.1 溶栓酶的分离纯化

4.2 溶栓酶对优球蛋白凝块的溶解作用

4.3 溶栓酶的急性毒性作试验

4.4 溶栓酶抗栓、溶栓作用

4.5 溶栓酶对小鼠出血、凝血时间的影响

4.6 溶栓酶对全血块、全血浆凝块的溶解作用

4.7 溶栓酶在小鼠体内的代谢

5 结论

参考文献

附录

致谢

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摘要

随着物质生活水平的提高,血栓疾病也越来越威胁人类的健康和生命,并且会引发严重的后果。微生物溶栓酶是一类具有良好应用前景的溶栓酶,不仅能够大量生产,还能弥补传统溶栓剂的缺点。本实验室已从豆豉中分离出一株具有产高纤溶活性的溶栓酶的菌株,命名为枯草芽孢杆菌LD-8547。
   本实验经过发酵、盐析、透析、浓缩等步骤得到粗酶液,再用Sephadex G-100凝胶分子筛柱纯化豆豉溶栓酶,得到分子量约为31 kDa的单一条带,纯化后测得酶活为21750 U/mL。通过豆豉溶栓酶对优球蛋白凝块的溶解试验,表明溶栓酶(469 U)能显著溶解优球蛋白凝块,并具有剂量依赖性。
   通过对豆豉溶栓酶急性毒性的初步研究,结果表明小鼠灌胃给药溶栓酶691586 U/Kg,发现给药小鼠与空白对照组情况相似,两周内均无死亡,小鼠解剖后,各脏体比均与对照组无显著差异,说明溶栓酶的口服灌胃LD50远大于691586 U/Kg。小鼠连续灌胃给药豆豉溶栓酶一周,测定体内出血时间、体外凝血时间、全血块及全血浆凝块溶解作用。结果表明,溶栓酶(4412 U)对小鼠出血、凝血时间有一定延长作用,溶栓酶(8200 U)能明显提高血块的溶解率,而溶栓酶(4100 U)能明显提高血浆凝块的溶解率,并随剂量的提高而作用加强。
   通过角叉菜胶诱发小鼠尾部血栓及兔颈动脉血栓的溶解试验,表明豆豉溶栓酶(2051 U)对小鼠尾静脉血栓形成平均长度有一定影响,并随剂量增大抑制血栓形成的作用增强。溶栓酶(1035 U/kg)对兔颈动脉血栓有良好的溶解作用。小鼠腹腔注射豆豉溶栓酶(5137 U)后,发现血清中的豆豉溶栓酶活力先升高再下降,在20 min时酶活力最高,半衰期为32.75 min。通过实验,发现豆豉溶栓酶具有一定的抗栓及溶栓作用,且口服安全性好,是一种良好的潜在治疗血栓的药物。

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