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荔枝EC长期继代保持与体胚发生及其蛋白质组学研究

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本研究以荔枝胚性愈伤组织(Embryogenic callus)、荔枝转基因抗性胚性愈伤组织(Transgenic resistant embryogenic callus)、荔枝转基因原生质体再生的胚性愈伤组织(Embryogenic callus derived from transgenic protoplasts,TPEC)细胞系为材料,将其长期继代保持,并进行荔枝体胚发生的同步化调控,在前人建立的高频率体胚发生的技术体系上诱导其体胚发生;通过RAPD和GUS检测,进一步研究荔枝不同类型细胞系的差异及GUS表达情况;以荔枝TPEC细胞系中的Q81.535为材料,研究其在添加和不添加ZT的条件下体胚发生过程的蛋白质双向电泳分析;并对荔枝体胚发生过程中相关蛋白进行了质谱鉴定及其功能分析。主要研究结果如下:
　　 1荔枝不同类型细胞系胚性愈伤组织的长期继代保持及差异
　　 荔枝EC、TREC和TPEC在前人继代保持的基础上,又将其延长保持了3年,并且愈伤组织仍然呈淡黄色、生长旺盛、颗粒细小且松散,保持着很好的胚胎发生能力。并对部分荔枝TREC和TPEC不同细胞系的胚性愈伤组织进行了GUS化学组织检测,抗性细胞系Q811、Q81.535为大量稳定表达GUS类型;Q9223为嵌合表达GUS类型;Q1016则为稳定不表达GUS类型;TPEC不同细胞系中,Q811、Q81.535细胞系GUS为大量稳定表达GUS类型,Q9223为嵌合表达GUS类型,Q1016则为稳定地不表达GUS类型。比较了荔枝不同类型细胞系在外观(形态、色泽)和生长状态上的差异,并对部分荔枝TREC和TPEC不同细胞系的胚性愈伤组织进行了PAPD分析,其差异不是非常明显。
　　 2荔枝体胚发生过程中总蛋白点数目变化
　　 使用线性IPG胶条(PH4-7)在Ettan IP GphorⅢ(GE Healthcare)进行第一向等电聚焦,采用SE600 Rube标准垂直电泳系统(GE Healthcare)进行第二向SDS-PAGE,银染法染色后凝胶采用Imagine ScannerⅢ(GE Healthcare)扫描仪采集图像,在Image Master2D Platinum6.0软件(GE Healthcare)上做图像分析。结果表明:荔枝体胚发生过程中总蛋白点数目变化趋势为先迅速上升,在MS20d升至最高点,后略有下降,再迅速下降,并且蛋白点数目在MS30d时降低至最低值,然后又经历一个迅速升高并保持稳定的过程。体胚发生中期,即从ZT20d-ZT30 d其蛋白点数目变化剧烈,经历了先迅速下降后迅速上升的过程。
　　 3荔枝体胚发生过程中总蛋白点等电点(pI)变化
　　 荔枝体胚发生过程中等电点在4-5范围内的蛋白点比例随着不同培养时间和条件变化并不剧烈,蛋白点比例范围几乎都在10.00％-20.00％,其比例变化呈现先缓慢降低,后迅速升高,然后几乎保持稳定,再降低,迅速升高,最后迅速降低。pI值在5-6范围内的蛋白点比例变化呈现先缓慢降低,后迅速升高,再缓慢下降。pI值在6-7范围内的蛋白点比例变化呈现先缓慢升高,在MS20d时达到最高,后迅速下降,然后几乎保持稳定,然后再缓慢下降,最后上升,总的变化趋势类似“N”。
　　 4荔枝体胚发生过程中总蛋白点分子量(MW)变化
　　 在荔枝体胚发生过程中分子量(MW)30KD-45KD的蛋白点变化趋势与分子量(MW)45KD-66KD的蛋白点变化趋势基本一致,先迅速升高,后降低,再升高,再降低,最后上升。分子量(MW)20.1KD-30KD的蛋白点变化趋势呈现先快速上升,后略有下降,然后再上升,基本保持稳定,变化不是非常明显。分子量在14.4KD-20.1KD的蛋白点变化趋势呈现先升高再降低,然后再升高,在MS40d时达到最大,后又快速下降。分子量在66KD-97KD范围内的大分子量蛋白点变化趋势先升高,然后略有降低,然后基本保持不变。
　　 5荔枝体胚发生过程中15KD小分子量蛋白点数目变化
　　 在荔枝体胚发生过程中,小分子量蛋白数目基本呈先升高再大幅降低,后略有升高,最后又大幅下降的趋势,而小分子量蛋白点比例与小分子量蛋白数目变化趋势不同,而是呈现先略有降低再大幅升高,后快速降低,然后大幅升高,最后又降低的趋势,但是体胚发生在MS40d时期无论小分子量蛋白数目和比例都最高(10个,2.54％),小分子量蛋白在此时积累达到高峰。@6荔枝体胚发生过程相关蛋白表达变化
　　 在添加ZT培养基上荔枝正常体胚发生过程中,能量和碳代谢相关蛋白、细胞组成与信号转导相关蛋白的表达呈先降低再升高趋势;胁迫反应/氧化还原相关蛋白、脂类代谢相关蛋白呈现逐步升高的趋势;蛋白质代谢与修复相关蛋白、氨基酸代谢相关蛋白的表达呈升高再降低的状态;核酸代谢相关蛋白呈现先下降再上升,最后又下降的趋势。
　　 在未添加ZT培养20 d时,能量和碳代谢相关蛋白、细胞组成与信号转导相关蛋白、核酸代谢相关蛋白、脂类代谢相关蛋白、蛋白代谢与修复相关蛋白有较强表达,而在添加ZT培养20 d时则表达较低或不表达;胁迫反应/氧化还原相关蛋白、氨基酸代谢相关蛋白在添加ZT培养20 d时表达比未添加ZT20 d时强。
　　 7荔枝体胚发生过程中相关蛋白的功能分析
　　 在荔枝体胚发生过程中,40个蛋白质谱成功鉴定19个蛋白,再加上本实验室李焕苓(2009)鉴定成功的10个蛋白,在这29个蛋白中,除20.69％功能未知的蛋白外,27.59％蛋白涉及胁迫应答和氧化还原,24.14％蛋白和蛋白质代谢与修复相关,13.79％蛋白涉及能量和碳代谢,3.45％涉及信号转导,3.45％涉及核酸代谢,3.45％涉及脂类代谢,3.45％涉及氨基酸代谢。

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