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四种药用植物内生真菌的分离纯化及其次级代谢产物的生物活性研究

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植物内生真菌(Endophytic fungus)是一个系统庞大而特殊的真菌类群，它是指其生活史的一定阶段或是全部阶段均生活于健康植物的各个组织和器官内部，在植物组织体内并没有引起明显病害症状的一类真菌，与宿主植物的关系也表现为互惠共生。内生真菌产生丰富的次级代谢产物(如抗肿瘤、抑菌、杀虫等活性物质)，是人们寻找新型药物的重要来源。因此，本课题选取四种药用植物作为材料，对其内生真菌及其生物活性、化合物等方面进行了初步研究，主要的内容和结果如下：
　　 1、运用组织切块法，分别从一品红(Euphorbia pulcherrima)、半夏(Pinellia ternate(Thunb.) Breit)、细辛(Asarum heterotropoides var.mandshuricum)、狼毒(Stellera chamaefasme)植物组织中分离得到14株、14株、13株、12株内生真菌，共计53株内生真菌。并对53株内生真菌的发酵液和菌丝体进行提取，得到发酵液乙酸乙酯部位萃取物、发酵液水饱和正丁醇萃取物和菌丝体醇提物。
　　 2、运用改良的Ellman法、MTT法和滤纸片扩散法，对粗提物进行抗乙酰胆碱酯酶、抗肿瘤及抑菌活性的检测。抗乙酰胆碱酯酶活性显示，有7种内生真菌萃取物具有抑制乙酰胆碱酯酶活性，在终浓度为1mg/mL浓度下，其抑制率在50％以上，其中以XX-10发酵液正丁醇萃取物的抑酶活性最强达79％。抗肿瘤结果显示，共有56个样品对Hela细胞有不同程度的抑制作用，抑制率在50％以上的有4株，其中3株来自植物一品红内生真菌(YPH-4(s)、YPH-7(s)、YPH-13(s))，1株来自于细辛(XX-13-正丁醇)。抑菌结果为，在植物半夏、一品红、狼毒、细辛内生真菌次级代谢产物粗提物样品中，具有抑菌活性的样品分别占各植物内生真菌总样品数的37.8％、58.1％、57.1％、40％，多数样品对一种或两种指示菌起抑制作用，有11个样品对6种指示菌均有不同程度的抑制作用。其中，BX-8(s)对于大肠杆菌与地衣芽孢杆菌抑制效果显著。
　　 3、运用重结晶、柱层析、薄层层析等分离技术，对BX-9菌株乙酸乙酯萃取物和BX-8菌株菌丝体醇提物中的化合物进行分析，得到(+)-BrefeldinA(布雷菲德菌素A，BFA)(1)、2-Hydroxy-14-tricosenvic acid(2-羟基-14-二十三烯酸)(2)、ergosterol(麦角甾醇)(3)、ergosterol peroxide(麦角甾醇过氧化物)(4)。其中，BFA(1)是一种大环内酯类抗生素，BFA及其衍生物是重要的抗肿瘤候选药。本文从BX-9菌株乙酸乙酯萃取物中得到布雷菲德菌素A的产量达100mg/L发酵液，显示出较大的商业前景。
　　 4、对分离出来的化合物1-4进行了抑菌活性、抗氧化活性和抗肿瘤活性检测，结果表明，化合物3对于金黄色葡萄球菌的抑菌活性较高，其最小抑制浓度为60μg/mL；四个化合物均未表现出明显的自由基消除活性；化合物1对Hela、HepG2、A549等肿瘤细胞的抑制作用都有阈值，当浓度小于1μg/mL时，对三株细胞株的抑制作用很弱，而浓度范围在1-50μg/mL时，化合物1对上述三种肿瘤细胞具有较强杀灭作用，但浓度依赖关系并不明显，抑制率均在64％左右。化合物3和4在终浓度为100μg/mL时，对癌细胞的抑制作用均很显著，当终浓度降为50μg/mL时，化合物3的细胞毒性依旧较强，而化合物4的细胞毒性明显减弱。
　　 5、运用分子生物学手段，对菌株BX-9和菌株BX-8的ITS区序列分析，并在Blast上与其同源度较高的ITSrDNA序列进行比对，通过聚类分析，以及结合菌落形态颜色及菌丝体、分生孢子梗的观察，鉴定菌株BX-9为半知菌类中的丛梗孢目丛梗孢科的青霉属(Penicillium sp.)真菌，鉴定BX-8为半知菌类黑盘孢目黑盘孢科的炭疽菌属(Colletotrichum sp.)真菌。

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