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食品动物源沙门菌中fosA3基因的传播分子特征

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1 前言

1. 1 沙门菌耐药现状

1. 2 磷霉素耐药机制及其耐药现状

1. 3 CT X-M型ES BLs研究进展

1. 4 适应性和适应性代价

1. 5 研究的目的及意义

2. 1 材料

2. 2 方法

3. 1 细菌的复苏及分离鉴定结果

3. 2 磷霉素耐药基因的检测结果

3.3 fosA3阳性菌的药物敏感性试验结果

3.4 fosA3阳性菌中其他相关基因检测结果

3.5 fosA3阳性菌株的分子分型结果

3. 6 接合转移和转化试验结果

3. 7 转化子的质粒分析结果

3.8 携带fosA3基因质粒适应性分析结果

4 讨论

4.1 fosA3阳性沙门菌的流行及耐药性分析

4.2 携带fosA3基因的沙门菌分子分型分析

4.3 质粒介导的fosA3基因的传播机制分析

4.4 fosA3基因上下游环境分析

4. 5 细菌适应性的分析

5 全文结论

致谢

参考文献

附录

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摘要

近年来，随着抗菌药物的普遍使用甚至滥用，细菌多重耐药情况越来越严重，临床上可供选择用于治疗肠杆菌科细菌感染的药物越来越少。磷霉素作为老药，因其独特的抗菌机制，不与其他药物发生交叉耐药，且对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有良好的抗菌活性，因此又重新引起人们的关注。但随着磷霉素越来越广泛的应用，其耐药情况也日益严重，目前有关质粒介导的磷霉素耐药基因在沙门菌中传播的报道很少。本论文调查了质粒介导的磷霉素耐药基因 fosA3在食品动物源沙门菌中的流行状况，进一步研究了其遗传特征和播特特征，为控制和减少磷霉素耐药性的出现及其在兽医临床应用的风险评估提供参考依据。
　　对本实验室2009～2014年间保存的288株食品动物源沙门菌采用PCR方法进行磷霉素耐药基因fosA3，fosA和fosC2的检测，结果筛选得到6株（2.1%）fosA3阳性沙门菌，均来自鸡粪便拭子样本。没有检测到fosA和fosC2基因。
　　采用琼脂稀释法测定6株fosA3阳性菌株对17种抗生素的敏感性，结果显示所有菌株均表现出多重耐药，对头孢噻肟、头孢噻呋、头孢曲松、氨苄西林、氯霉素、氟苯尼考、卡那霉素、链霉素、环丙沙星、恩诺沙星、萘啶酸、以及四环素的耐药率高达100%。所有菌株均对庆大霉素、阿米卡星、头孢他啶和喹乙醇高度敏感。采用PCR方法检测 fosA3阳性沙门菌中超广谱β-内酰胺酶基因（blaCTX-M-1G、blaCTX-M-2G、blaCT X-M-8G、blaCT X-M-9G、blaCTX-M-25G、blaT EM、blaSHV、blaOXA）和floR基因，发现所有菌株同时携带blaCT X-M-9G（均为blaCTX-M-14）基因和floR基因。
　　采用玻片凝集法确定其血清型，检测结果表明所有菌株均为印第安纳型。采用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）分析菌株间的亲缘关系。PFGE结果显示6株fosA3阳性菌株图谱相似，说明菌株间存在克隆传播；MLST结果表明6株菌均为ST17型。
　　采用接合转移/转化、复制子分型、S1-PFGE和Southern杂交等对fosA3基因的水平传播和质粒特征进行了分析。通过电转化方法得到6株fosA3阳性转化子，且3株fosA3阳性沙门菌中blaCT X-M-14基因同fosA3基因共同转移到受体菌中，复制子分型结果显示，6株fosA3阳性菌中，1株携带IncA/C型质粒，5株均携带IncN和IncA/C型复合型质粒。对转化子进行S1-PFGE分析，并分别与fosA3、blaCTX-M-14、IncN和IncA/C探针进行Southern杂交，结果显示fosA3位于两种大小不同的质粒上，IncA/C质粒大小约为80kb，IncN和IncA/C型复合型质粒大小有两种情况，约为80kb和170kb。质粒分析结果表明fosA3基因能通过IncN或IncA/C型质粒与blaCTX-M基因发生共同转移。
　　采用PCR-mapping的方法对6株fosA3阳性沙门菌株中的fosA3基因上下游环境序列进行分析，结果显示所有的fosA3基因两端都有IS26插入序列，其中3株菌的fosA3基因上游还含有blaCT X-M-14基因。
　　通过生长曲线、稳定性试验和竞争试验分析携带有fosA3基因和同时携带fosA3、blaCT X-M-14基因的质粒对宿主菌适应性的影响。结果表明质粒的存在对宿主菌的生长没有显著的影响，但仅携带有fosA3基因的质粒在宿主中不稳定，在竞争中与宿主菌相比处于劣势，而同时携带fosA3、blaCTX-M-14基因的质粒能够在宿主菌中稳定存在，且在竞争试验中有竞争优势，没有产生较高的适应性代价。
　　本研究首次在国内不同地区的鸡粪便拭子样本中分离得到的沙门菌中检测到fosA3基因，菌株的克隆传播和fosA3与blaCTX-M-9G随质粒的水平传播都加速了耐药性的散播，fosA3与blaCT X-M-14基因共同发生转移的质粒可在宿主菌中稳定传播，能够提高菌株的竞争优势，对公共卫生构成潜在威胁。

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