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有效提高非模式生物蛋白质组鉴定的新策略——逐次修正基因组法

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第一章 引言

1.1 微生物蛋白质组研究现状

1.2 生物质谱对于蛋白质组研究的意义

1.3 高通量测序的应用与发展

1.4 非模式物种的基因组、蛋白质组研究策略

1.5 新策略、新方法

第二章 材料及方法:

2.1 实验材料

2.2 实验试剂

2.3 实验仪器

2.4 物种鉴定

2.5 估算基因组大小

2.6 全基因组测序

2.7 逐次mapping与基因组修正

2.5 细胞培养和蛋白质的提取

2.6 单向SDS-PAGE分离蛋白质和胶内酶解

2.7 LC-MS/MS分析

2.8 肽段的数据库检索和蛋白质鉴定

第三章 结果

3.1 策略

3.2 物种鉴定结果与基因组大小的测定

3.3 DNA文库的构建

3.4 利用二代测序数据(NGS)逐次修正基因组

3.5 基因组修正的实验验证

3.6 肽段与蛋白鉴定率的提高

3.7鉴定含有氨基酸突变位点(SAV)的肽段

第四章 讨论

4.1 新策略有助于促进非模式生物蛋白质组的研究

4.2 精确、高效、稳定的算法(FANSe)是基因组修正准确性的保障

4.3 逐次mapping的基因组修正策略对于高变异度物种基因组修正的意义

4.4 新策略在基因组、转录组研究方面的应用

4.5 新策略的不足与改进方法

参考文献

附录

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致谢

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摘要

随着人类基因组计划的实施和推进,蛋白质组学的研究也越来越受到科研人员的关注。现阶段液相质谱串联质谱法成为了蛋白质鉴定的核心技术。但是此项技术高度依赖于已有的蛋白质数据库,很难应用于新蛋白的发现与研究。因此,这种方法严重阻碍了未知基因组的非模式生物蛋白质组的研究与发展。针对上述情况,我们提出了一个新策略。该方法可以利用已有的基因组数据库来不断完善未知基因组生物的基因组信息,从而获得这些生物的蛋白质组数据库用于后续的蛋白质组分析和研究。
  新策略运用了我们自主开发的、稳定、精确、容错率高的FANSe高速序列比对算法(Fast and Accurate mapping tool for Nucleotide Sequencing datasets)逐次修正已知近缘物种的基因组,以期获得研究物种的真实基因组。实验中,我们提取了一株没有完整参考基因组的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株的DNA进行了全基因组测序,并提取了该菌株的全蛋白进行了质谱鉴定。为了有效的评估修正后基因组对于蛋白质组研究的影响,我们采用了修正前后两种蛋白质数据库对实验菌株全蛋白的质谱鉴定结果进行了MASCOT搜库。结果显示:与原始库相比,修正库能够提高11.5%的蛋白鉴定率和14.2%的肽段鉴定率。
  研究表明,基于新策略得到的蛋白质数据库能够明显的提高肽段和蛋白质的鉴定效率。更重要的是,新策略能够鉴定氨基酸序列的突变,从而发现肽段和蛋白质的变异。新策略对于非模式生物蛋白质组的研究将具有极大的促进作用以及深远的影响。

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