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模拟微重力状态下过氧化物酶体增殖物激活受体γ基因表达对成骨分化的影响

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摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

第三章 结果

1 SD大鼠骨髓间充质干细胞的提取和体外培养

2 模拟微重力对体外培养骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

3 吡格列酮及GW9662对体外模拟微重力条件下骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

第四章 讨论

1 SD大鼠骨髓间充质干细胞的提取和纯化

2 模拟微重力对BMSCs向成骨细胞分化的影响

第五章 结论

本实验需进一步探讨问题

参考文献

附录 中英文对照缩略词表

攻读学位期间发表论文

致谢

声明

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摘要

背景：
　　 微重力又称零重力，是相对于地球表面1g重力环境而言的一种“零重量”状态，也是人类在太空工作及生活所处的环境。人类长时间处于微重力状态下可引起各种病理生理变化，其中包括骨质疏松、肌肉萎缩、免疫功能下降等，而骨质疏松症是其中最常见、最严重的并发症之一。据报道，空间飞行中平均每月出现2％的骨丢失，相当于绝经后妇女1年的骨丢失，且返回地面后骨丢失持续存在，这严重影响到飞行员健康。国内外现有研究认为，微重力诱导的骨质疏松症主要发病机制是空间飞行导致成骨细胞(OB)形状及结构明显改变，细胞多呈现浓缩核或核分散，由于重力作用而导致破骨细胞活化引起骨吸收增加，成骨细胞完整性及矿化结节形成功能缺失。现有的药物、物理治疗未能起到理想的治疗效果，极大地限制了今后的航天载人事业发展及人类长期在太空工作、生活。为探求其他防治失重性骨质疏松的方法，模拟微重力下骨代谢及细胞信号通路的研究已经成为国内外航天医学领域的热点课题之一。
　　 1990年Issemann[2]等首先发现了一类能被脂肪酸样化合物过氧化物酶体增殖剂(peroxisome proliferators，PP)激活，而被命名为PP激活受体(peroxisomeprolifemtor-activated receptor，PPAR)。PPAR是一类广泛参与糖脂调节、脂肪储存基因表达的核转录因子，属于核受体超家族成员。在两栖类、啮齿类及人类PPARs由于基因的启动子和拼接方式不同均存在3种亚型，即PPAR a、PPARβ（亦称PPARδ或NUC-1）和PPARγ。PPARγ主要表达于脂肪组织，在胰岛B细胞、血管内皮细胞及巨噬细胞也有表达，已被公认在调控脂肪细胞分化与糖、脂肪及能量等多种代谢中起重要作用，其基因位于染色体3p25。PPARγmRNA含有9个外显子，基因组DNA全长约100 kb，存在着4种异构体即PPARγ-1、PPARγ-2、PPARγ-3和PPARγ-4。近年来有研究发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）还与激活蛋白21(AP21)、信号转导与转录激活子1(STAT1)、Fos蛋白家族成员δFosB蛋白、细胞周期素D等因子及Wnt信号通路协同作用调控细胞的分化、生长和凋亡，其中包括骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化过程。PPARγ信号通路可通过激活或关闭下游信号调节骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化方向，即增加或减少干细胞向成骨细胞分化，从而调节成骨细胞数量。骨髓间充质干细胞，具有多向分化潜能，可分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞、肌细胞和神经细胞等[3-5]。
　　 噻唑烷二酮类药物作为PPARγ细胞信号通路的人工合成受体，在极低剂量下（毫微克分子）即可激活PPARγ细胞信号通路。吡格列酮作为噻唑烷二酮类药物代表之一，现广泛应用于糖尿病治疗，选取其作为实验用PPARγ细胞信号通路激动剂，更具有临床意义。GW9662是PPARγ细胞信号通路常用的抑制剂，其效果被国内外实验所肯定而广泛应用于抑制PPARγ细胞信号通路。
　　 本实验设计将骨髓间充质干细胞复合于微载体上，在模拟微重力旋转培养系统(RCCS)中进行向成骨细胞分化诱导，通过激活及抑制PPARγ通路，检测骨髓间充质干细胞在成骨分化过程中所受的影响。期望本实验结果为骨质疏松症的信号转导机制进一步积累科学依据及提供可能的新治疗方向。
　　 目的：
　　 观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ细胞通路在体外模拟微重力状态下对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响及吡格列酮、GW9662对氧化物酶体增殖物激活受体γ基因表达的影响。
　　 对象和方法：
　　 1.BMSCs的分离、培养、扩增:取材5周龄SD大鼠股骨及胫骨骨髓作BMSCs原代培养，冲出的骨髓细胞悬液装入预先准备的15ml离心管，室温下以1000r/min离心5min，弃上清、脂肪及杂质，F12/DMEM重悬，洗涤细胞;用含有10％胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，接种于25cm2培养瓶中，加入完全培养液(10％FCS、青霉素G100U/ml，链霉素100U/ml的DMM/F12培养基)，37℃、5％CO2培养箱中培养。依据贴壁培养法分离和进行细胞传代，取第4-5代骨髓间充质干细胞作为研究对象。
　　 2.BMSCs性质鉴定:采用流式细胞仪进行检测细胞表面CD29、CD34、CD44分子表达并绘制成流式图。
　　 3.实验分组:实验分为:正常重力组(NG)、模拟微重力组(MG)、模拟微重力+10μmol/L吡格列酮组(MG+PIO)、模拟微重力+10μmol/LGW9662组(MG+GW)、模拟微重力+10μmol/L吡格列酮+10μmol/L GW9662组(MG+PIO+GW)。正常重力组在正常重力下以贴壁培养法培养14d，模拟微重力组和模拟微重力+吡格列酮和（或）GW9662组均在旋转式重力反应器中模拟微重力培养14d。细胞培养14d后，实验组均用2ml0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA溶液在37℃下消化1-2min，离心收集OB进行检测。
　　 4.观察各组14d后使用茜素红染色检测成骨结节、细胞内碱性磷酸酶活性检测、油红-O染色检测脂肪细胞及计算成脂率、两步法RT-PCR（半定量反转录—聚合酶链反应）检测PPARγ基因的mRNA表达情况。
　　 5.统计学数据采用SPSS13.0进行统计分析，实验数据计量资料以均数±标准差(x±S）表示，多组均数比较采用完全随机设计资料的方差分析，描述性统计分析单因素方差分析(One Way) ANOVA及LSD方法进行多样本均数两两比较，方差齐性采用Levene检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.BMSCs生长情况:原代大鼠BMSCs接种后，细胞形态大小不一，呈圆型。24小时换液后，细胞贴壁生长3d，可观察到成纤维细胞样的细胞集落，细胞伸出长短不一，粗细不均的突起，胞浆丰富，胞核大，核仁清晰，每隔两天在无菌条件下进行全量换液以祛除杂质。7至9d后细胞呈集落生长，呈同向旋涡状排列。10至12d后细胞排列紧密，逐渐融合成片。进行细胞传代纯化培养，每隔3至4d科传代一次，连续传代4-5代后，细胞生长旺盛，形态均一，呈梭形生长，胞浆丰富，细胞核明显，每个细胞有一两个核仁。
　　 2.BMSCs性质鉴定:采用流式细胞仪检测细胞表面CD分子表达，结果显示CD29(99.52％)、CD34(0.58％)、、CD44(41.88％)，鉴定结果显示出间充质干细胞的特性，CD34间充质干细胞表面标志抗原表达阴性，而CD29、CD44间充质干细胞表面标志抗原表达阳性。以上结果与李晓峰[6]等结果一致，可证实其为大鼠骨髓间充质干细胞。同时将BMSCs加入成骨细胞分化诱导液，进行成骨诱导分化鉴定。
　　 3.成骨细胞的鉴定:经成骨诱导液连续分化培养14d后，茜素红染色后在倒置显微镜下可见细胞内红色或褐色矿化结节。模拟微重力组视野内矿化结节较正常重力组减少，模拟微重力+吡格列酮组视野内矿化结节较微重力组明显减少，细胞排列紊乱，模拟微重力+GW9662组视野内可见矿化结节较模拟微重力组轻微增多，模拟微重力+吡格列酮+GW9662组视野内矿化结节较模拟微重力组增加，与模拟微重力+GW9662组相比减少。
　　 4.碱性磷酸酶(ALP)活性检测:与正常重力组相比，模拟微重力培养的细胞碱性磷酸酶活性差异有统计学意义(P＜0.01)，模拟微重力培养的实验组别碱性磷酸酶活性降低。与模拟微重力组相比，模拟微重力+吡格列酮组的细胞碱性磷酸酶活性较低，差异有统计学意义(P=0.001)，模拟微重力+GW9662组的细胞碱性磷酸酶活性较高，差异有统计学意义(P=0.002)。与模拟微重力+吡格列酮组相比，模拟微重力+GW9662组及模拟微重力+吡格列酮+GW9662组的细胞碱性磷酸酶活性较高，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　 5.脂肪细胞的鉴定及成脂率计算:与正常重力组相比，模拟微重力培养的细胞中脂肪细胞数量及成脂率差异有统计学意义(P＜0.01)，模拟微重力培养的实验组别成脂率升高。与模拟微重力组相比，模拟微重力+吡格列酮组及模拟微重力+GW9662组的成脂率差异有统计学意义(P＜0.05)，模拟微重力+吡格列酮组成脂率升高，模拟微重力+GW9662组的成脂率降低。与模拟微重力+吡格列酮组相比，模拟微重力+GW9662组及模拟微重力+吡格列酮+GW9662组的成脂率差异有统计学意义(P＜0.05)，均低于模拟微重力+吡格列酮组。
　　 6.OB的PPARγ的mRNA的表达:RT-PCR结果显示:与正常重力组相比，模拟微重力组及模拟微重力+吡格列酮组PPARγ的mRNA表达均升高，差异有统计学意义(P＜0.05);与模拟微重力+吡格列酮组相比，模拟微重力组、模拟微重力+吡格列酮组及模拟微重力+吡格列酮+GW9662组PPARγ的mRNA表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1.“全骨髓贴壁培养法”培养原代培养大鼠骨髓间充质干细胞是一种科学有效、简单可靠的骨髓间充质干细胞分离、培养、纯化和扩增方法。
　　 2.体外模拟微重力培养骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，降低成骨分化率，并增加干细胞向脂肪细胞分化几率，打破成骨细胞和脂肪细胞之间平衡，使骨基质形成、成熟和矿化作用降低，上调了PPARγ基因的mRNA表达。
　　 3.吡格列酮可以进一步减少骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，促进干细胞向脂肪细胞分化，加重骨基质形成、成熟和矿化的障碍，并上调PPARγ基因的mRNA表达。
　　 4.GW9662可以部分逆转模拟微重力状态对骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞的抑制作用，抑制脂肪细胞生成，下调PPARγ基因的mRNA表达。
　　 5.PPARγ细胞信号通路的激活可能是造成模拟微重力诱导的骨质疏松症发病机制的重要原因之一。

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