与对虾血蓝蛋白具有相似抗原决定簇的副溶血弧菌外膜蛋白的鉴定及其免疫学意义的研究

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随着对虾养殖业的快速发展，养殖过程中爆发的细菌性疾病给对虾养殖业造成了严重的经济损失。为此，学者们认为深入揭示病原菌侵袭对虾的分子机制是解决对虾养殖疾病的有效途径之一。有趣的是，课题组前期研究意外发现，兔抗虾血蓝蛋白抗体可与副溶血弧菌某些外膜蛋白发生明显的交叉反应，但该外膜蛋白的性质及其在侵染对虾过程中的地位尚不清楚。为此，本研究采用蛋白质组学、分子生物学、生物信息学、免疫学等策略对其进行了较为深入的研究，所获主要结果如下：
　　首先，采用SDS-PAGE、2-DE、Western-blotting、MALDL-TOF-TOF/MS等蛋白质组学技术，发现与兔抗血蓝蛋白抗体发生交叉反应的副溶血弧菌外膜蛋白为LamB蛋白。
　　继而，采用分子生物学策略，对LamB蛋白进行基因克隆与原核表达，成功获得 LamB重组子(pMD-19-T-LamB和pET-32a(+)-LamB)及其原核表达蛋白（rLamB）。在此基础之上，进一步运用亲和层析、Western-blotting和Dot-ELISA等技术证实 rLamB蛋白确实可以与兔抗虾血蓝蛋白抗体发生交叉反应，与蛋白质组学鉴定结果一致。尤其值得一提的是，抗原表位预测发现LamB蛋白与对虾血蓝蛋白可能存在11个相似的同源性抗原表位。由此推测，副溶血弧菌 LamB蛋白应该是一种与对虾血蓝蛋白具有相似抗原决定簇的蛋白。
　　最后，采用免疫共沉淀、LC-ESI-MS/MS等技术，发现LamB蛋白可能可与对虾血浆中的β-1,3-葡聚糖结合蛋白(beta-1,3-glucan-binding protein，LGBP)、β-肌动蛋白(beta-actin)、Toll2、肌动蛋白T2(actin T2)、烯醇酶(enolase partial)、精氨酸激酶(arginine kinase，AK)和血蓝蛋白(hemocyanin，HMC)等7种蛋白发生相互作用。在此基础上，进一步采用Real-time PCR技术分析rLamB蛋白刺激对虾后，其4种相互作用蛋白（β-1,3-葡聚糖结合蛋白、血蓝蛋白、toll2和精氨酸激酶）在mRNA表达水平的变化。结果显示，该4种对虾免疫因子表达量均出现“先下降后上升再下降”的模式，除精氨酸激酶12h下降最为明显之外，其它3种免疫因子均在6h下降最为显著。由此提示，在副溶血弧菌侵袭对虾早期，副溶血弧菌有可能通过其LamB蛋白对对虾宿主重要免疫因子进行负调控。
　　综上所述，本研究首次在副溶血弧菌中发现一种与其宿主免疫因子（血蓝蛋白）具有相似抗原决定簇的外膜蛋白LamB，且LamB蛋白对其宿主主要免疫因子表现出较好的负调控作用。所获研究结果对揭示副溶血弧菌感染对虾的分子机制具有重要意义，同时为对虾病害的免疫学防治提供了重要的科学依据，促进对虾养殖业健康、持续发展。

著录项

作者
杨冬;
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作者单位

汕头大学;

展开▼
授予单位汕头大学;
学科海洋生物学
授予学位硕士
导师姓名章跃陵;
年度 2014
页码
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 S945.46;
关键词
对虾; 血蓝蛋白; 副溶血弧菌外膜蛋白; 抗原决定簇; 免疫共沉淀;

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