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三种海洋微生物Sporothrix sp.＃4335，Paecilomyces sp.Tree 1-7与Rhodomarinobacter sp.nov代谢产物的研究

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第1章海洋微生物的代谢产物的研究进展

第2章南海红树林内源性真菌Sporothrix sp.#4335代谢产物的研究

第3章台湾海峡红树林腐生真菌Paecilomyces sp.Tree 1-7代谢产物的研究

第4章大亚湾海洋细菌Rhodomar inobacter sp.nov代谢产物的研究

第5章海洋内源性真菌#4335与真菌树1-7的发酵生理研究

附

博士期间已发表和待发表的文章：

致谢

原创性声明

知识产权保护声明

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摘要

海洋微生物代谢产物研究是近年来国际上新兴的研究课题。海洋微生物由于特殊的海洋生理环境，有独特的代谢途径，能产生结构独特，骨架新颖的各式各样次级代谢产物。海洋微生物活性物质开发是新型药物的重要来源，其研究具有非常重要的意义。 本文工作主要研究了三种海洋微生物的次级代谢产物，两种海洋真菌的发酵条件，及新化合物的药理活性研究—进行了抗肿瘤活性，抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)及抑菌活性的生理测试。从三种海洋微生物中共分离得到六十余种次级代谢产物，其中四十七个已经确定了结构，在菌＃4335中，有五个已经确定为结构新颖、生理活性良好的sporothrins系列新骨架化合物，一个小分子的不饱和脂肪链新化合物，一个类似灰黄霉素的新化合物；在菌Tree1-7中，五个初步确定为新化合物，该系列化合物也有很好的生理活性。此外其他三十多个化合物则经过与文献详细地对照，鉴定为已知化合物。对两种海洋真菌的发酵条件是在初筛了五十余种条件的基础上，进一步确定五种条件细筛，配以高效液相反相层析柱分析代谢产物，最后得到优化的培养条件。 第1章，综述了当今国内外海洋微生物的代谢产物研究进展，重点介绍了近年来发现的与已投入市场的源于海洋微生物的药物，包括抗肿瘤药，抗菌药与酶抑制剂。对于目前仍然无法根本解决的AIDS，简单地阐述了抑制HIV-1蛋白酶与整合酶活性的研究进展。近两年海洋微生物代谢产物的活性成分的研究表明，海洋微生物活性物质已成为本世纪开发新型药物的资源。随着相关文献引用的迅速增长，我国南海海洋红树林内生真菌的研究已经成为海洋微生物研究的一个新的热点，我国近海岸海洋微生物资源的开发和利用有着美好的应用前景。 第2章，研究了南海红树林内源生真菌Sporothrixsp.＃4335的次级代谢产物。到目前为止，从代谢产物中分离并确定结构的共有27个化合物，5个是尚未见报道的全新骨架的化合物，命名为sporothrinsA～E(2-1～2-4)，通过1HNMR、13CNMR、2DNMR和HREIMS等方法已经确定了A与B(2-1，2-2)的结构，A与B的相对立体构型通过X-单晶衍射得到证实。该系列化合物结构非常奇特，是由七个环系拼合而成，具有独特的三维立体结构，在自然界与人工合成中均未发现过。Sporothrins的碳架是由类似的两个8-羟基-萘-1-酮环与一个降-8-羟基-萘-1-酮环构成，三个相似的萘环在不同的方向各成一个平面(其中一个稍有不平)。SporothrinsA与B有弱的抗hepG2细胞活性(IC50值分别为50，20μg/mL)。SporothrinA有很好地抑制AChE的活性(IC50=1.05μg/mL)，分析结构发现，A分子中O-4到O-6的距离为5.5(A)，与AChE的活性中心的距离恰好一致(5.5(A))。另外，近几年文献中报道了一个筛选HIV-1蛋白酶的药效团模型，三个筛选HIV-1整合酶的药效团模型，经测量sporothrinsA与B的单晶结构发现，其中B有一个符合抑制HIV-1整合酶的药效团，O-1与O-4，O-4与O-5，O-5与O-1间的距离分别是8.745，2.574与8.152(A)(Neamati提出的抑制HIV-1整合酶的药效团之一：三个氧之间的距离分别为8.73±0.7(A)，2.71±0.7(A)，8.01±0.7(A))。另外在sporothrinA中，O-6与O-4，O-4与O-3，O-3与O-6的距离分别是5.507，2.574与5.396(A)，在sporothrinB中，O-5与O-3，O-3与O-2，O-2与O-5的距离分别是4.529，2.555与5.521(A)，与Shaomeng提出的蛋白酶药效团(三边距离分别为5.1±1.0，2.8±1.0，5.4±1.0(A))一致。由此可以看出，由于sporothrins系列化合物独特的三维立体结构及多个羟基与羰基，与已经开发出的HIV-1蛋白酶或整合酶抑制剂的特点不谋而合，所以该系列物抑制HIV-1的活性值得深入研究。SporothrinsA与B基本上都没有明显的抗菌与杀虫活性。SporothrinsC(2-3)与D是以混合物的形式得到的，2-3初步推测是七个环系中D，E环断开的结构，C与D结构非常相似，通过HPLC(10％甲醇/水)也很难分开，由NMR与EIMS推测可能仅差一个CH2，还未解决纯化D的问题；SporothrinE(2-4)初步推测是七个环系中E环断开的结构。另外从＃4335中还分得两个新化合物4-羟基-4，6-二烯-3-八酮(2-26)与rev-griseofulvin(2-27)，其中2-26是一个很简单的小分子不饱和脂肪链化合物，但对于解释sporothrins系列化合物的生物合成有很大的帮助；而2-27是类似于灰黄霉素的骨架部分反转的新骨架化合物。同时，在该菌中还分得一个结构复杂的萜类化合物—松胞素4(2-20)，diaporthin(2-5)，5-羧基蜂蜜曲菌素(2-6)，5-甲氧基-2-甲基-苯并-γ-吡喃酮(2-9)，2，3-二氢-3-甲基-4-苯并呋喃醇(2-10)，3-羟基-4-己烯酸(2-11)及一些小分子的香豆素与异香豆素类的化合物，环二肽和甾醇。从已确定结构的化合物可以看出，＃4335菌有生产丰富的具有活性的新次级代谢产物的能力。 第3章，研究了台湾海峡采集到的红树林树皮腐生真菌Paecilomycessp.Tree1-7的次级代谢产物。对该菌菌体的甲醇浸泡液的生理活性测试显示，该菌有非常好的生理活性，尤其是抗肿瘤活性。到目前为止，从代谢产物中分离并确定结构共有20个化合物，1个已经确定为新的呫吨酮类化合物paeciloxanthone(3-1)。3-1有很强的抗hepG2细胞活性(IC50=1.08μg/mL)，较好的酶抑制活性(IC50=2.25μg/mL)及一定的抗真菌与细菌的活性。另外得到三个同系列的化合物3-2～3-4(3-4为结构改造而得)及该骨架的内酯环裂开的化合物3-5与3-6，初步确定为系列新化合物。该系列物与已发表的penicillide系列在1DNMR上很相近，仅在物理性质及远程相关上有一定的差别。系列化合物3-2～3-4的抗肿瘤活性IC50分别为：65，1，75μg/mL，抑制体外AChE的活性IC50分别为：28.3，21.6，35.1μg/mL。其抗肿瘤与酶抑制活性均呈一定规律：小分子的酰基取代OH，使分子的酶抑制活性减弱(3-2，1个OH，3-3，2个OH，3-4，无OH)；而penicillide系列在抑制胆固醇酰基转移酶活性规律方面与之相反。进一步深入探讨骨架及其取代基对该系列化合物的影响，可能会揭开此类化合物新的代谢机理。Tree1-7中还分得一个生理活性非常好的secalonicacidA(3-4)，大黄素(3-8)与chrysophanol(3-9)，alaternin(3-18)，2，4-二羟基苯乙酮(3-10)，5，7-二羟基-2-甲基-苯并-γ-吡喃酮(3-11)，5，8-二羟基-4-甲基-香豆素(3-12)，3-羟基-3，6-二甲基-2，5-哌嗪(3-20)，四个环二肽及大量的甘露醇与甾醇。 第4章，研究了大亚湾海洋细菌Rhodomarinobactersp.nov的次级代谢产物。该菌在20℃下培养了五升，得到了主要的一个次级代谢产物Blue-1，蓝紫色粉末，经结构鉴定，确定为生理活性非常好的已知化合物violacein(紫色海杆菌素)；该菌在27℃下，则会代谢出灵菌红素与二甲基灵菌红素，而且在两个不同温度下的培养液各产生不同的颜色(深蓝色与紫红色)。该现象可能与信息分子高丝氨酸内酯(HHL)引起的感应效应有关，有关论文对比，并进行了简要的分析。Blue-1对人肝癌细胞BEL-7402和人胃腺癌细胞MCG803有很好的抑制作用，IC50分别为4.6，6.8μg/mL(此项测试文献未见报道)。 第5章，深入研究了海洋红树林内源生真菌＃4335与树皮腐生真菌Tree1-7两株菌的发酵培养条件，其中主要包括不同培养基的影响及其他培养条件(金属离子，温度，诱导剂)的影响，本章节所述研究工作是第1、2章节的有力补充，为下一步对该两株菌深入研究奠定了根本的基础。研究结果显示，培养基的差异，对真菌的代谢产物有较大的影响，但主要的代谢产物仍然是一定的。高效液相分析对于培养条件的筛选无疑是一种较轻便、快捷的方式。其次，设计并研究了金属在＃4335菌种的培养过程中影响的微型实验(这点是在Nature曾报道的一篇Fe在海洋微生物代谢中的影响的启发下设计的)。结果显示，大部分的微量金属对真菌的生长是有利的，尤其是Fe离子，不论是二价还是三价，均对＃4335菌造成较大影响，此项工作对下一步＃4335的深入研究有借鉴作用。另外，针对两次大批量培养＃4335的次级代谢产物差异，尤其是sporothrinA在第二次培养相对第一次培养得到了相差近五倍的量，而同时又得到四个同系物B～E，探讨了温度对＃4335菌次级代谢产物的影响。对于Tree1-7，第一次培养得到secalonicacidA，而第二次培养得到大黄素与chrysophanol，前者与后者不会同时出现，后两个化合物文献已有报道推断是secalonicacidsA的生物合成前体，研究并确定了在Tree1-7的代谢过程中也存在这种生物合成过程，同时对比了大黄素与chrysophanol对该菌中分得的新化合物3-1与3-5代谢的影响。

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