铜绿假单胞菌GF31氯氰菊酯降解酶的基因克隆及原核表达

声明

摘要

符号说明

1．1 引言

1．2 拟除虫菊酯类农药及其微生物降解研究

1．2．1 拟除虫菊酯的特性及其应用现状

1．2．2 拟除虫菊酯类农药的微生物降解

1．2．3 拟除虫菊酯类农药的微生物降解途径研究

1．3 拟除虫菊酯降解酶的研究

1．3．1 拟除虫菊酯降解酶的来源及性质

1．3．2 拟除虫菊酯降解酶的克隆和异源表达研究现状

1．3．3 蛋白质异源表达

1．4 荧光定量PCR技术研究现状

1．4．1 实时荧光定量PCR的原理及分类

1．4．2 实时荧光定量PCR在多领域的应用

1．5 本研究的目的及意义

1．5．1 研究的目的和意义

1．5．2 本文的主要工作

第二章 氯氰菊酯降解酶的基因克隆

2．1 材料和仪器

2．1．1 实验设备与型号

2．1．2 菌株与质粒

2．1．3 培养基

2．1．4 试剂盒、克隆用酶及其他试剂

2．2 实验方法

2．2．1 菌株GF31基因组的提取和纯化回收

2．2．2 PCR扩增菊酯降解酶基因APs

2．2．3 重组质粒APs-pET28a／pET30a／pET32a的构建及鉴定

2．2．4 APs基因工程表达菌的构建及鉴定

2．3 结果与讨论

2．3．2 氯氰菊酯降解酶基因APs的TA克隆及鉴定

2．3．3 构建重组质粒APs-pET28a／pET30a／pET32a

2．3．4 APs氨基酸序列比对

2．3．5 APs基因工程表达菌的构建及鉴定

2．4 本章小结

第三章 氯氰菊酯降解酶的表达、纯化及酶活测定

3．1 材料和仪器

3．1．1 实验仪器及生产厂家

3．1．2 菌株与质粒

3．1．3 培养基

3．1．4 蛋白电泳试剂及其他试剂

3．2 实验方法

3．2．1 相关溶液的配制

3．2．2 工程菌的培养和诱导蛋白的产生

3．2．3 SDS-PAGE蛋白电泳步骤

3．2．4 NI-NTA纯化

3．2．5 APs降解酶活力的检测

3．2．6 APs降解酶的氯氰菊酯降解活力检测

3．3 结果与讨论

3．3．1 BL21(DE3)中蛋白表达情况

3．3．2 Rosseta(DE3)中蛋白表达情况

3．3．3 Rosseta-gami中蛋白表达情况

3．4 本章小结

第四章 qRT-PCR相对定量方法的构建

4．1 实验材料与仪器设备

4．1．1 实验仪器及型号

4．1．2 实验试剂

4．1．3 菌株和培养基

4．2 实验方法

4．2．1 引物的设计与合成

4．2．2 16S rRNA-pET28a／pET30a／pET32a的构建

4．2．3 菌体培养

4．2．5 第一链cDNA的合成

4．2．7 检测工程菌中目的基因APs相对于GF31中APs的表达水平变化

4．3 实验结果与讨论

4．3．3 APs和16S rRNA引物退火温度的选择

4．3．4 引物特异性分析

4．3．5 扩增曲线分析

4．3．6 绘制标准曲线

4．3．7 工程菌中目的基因APs相对于GF31中ARs的表达水平变化

4．4 小结

第五章 结论与展望

5．2 展望

参考文献

致谢

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