鼠李糖乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因的克隆表达及同源重组质粒的构建

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乳酸是世界公认的三大有机酸之一，是一种重要的有机化工原料和精细化学品，广泛应用于食品、农业、环保、医药、饲料、日用品、化工等领域。以乳酸为单体经化学合成的新型生物可降解高分子材料聚乳酸，具有无毒，无刺激性，强度高，可塑性好且在自然界中能够被微生物彻底分解，不污染环境的优点，被认为是最有发展前途的可生物降解的高分子材料。乳酸生产及其应用的研究受到全球的广泛关注，而鼠李糖乳杆菌作为乳酸的重要生产菌株成为了关注的焦点。由于鼠李糖乳杆菌中存在L-型和D-型两种乳酸脱氢酶，生产的乳酸是DL-乳酸，不能产生高光学纯度单一构型的乳酸。本文在分子水平上，对鼠李糖乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因进行克隆并在大肠杆菌中表达，研究其D．乳酸脱氢酶的酶学特性；同时通过基因工程手段对鼠李糖乳杆菌的D-乳酸脱氢酶基因进行敲除，研究鼠李糖乳杆菌发酵生产高光学纯度的L-乳酸。目前，国内外对同类研究报道较少。
　　本论文以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus，JCM1553)为出发菌株，首先对其培养条件、生长周期等特性进行了研究；其次，从其总DNA中通过PCR扩增到D-乳酸脱氢酶基因(D-ldh)，将D-ldhDNA片段与表达质粒pET-22b(+)连接，构建了重组质粒pET-D-ldh。将重组质粒pET-D-ldh导入大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果表明D-ldh在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了表达。用紫外分光光度计测定重组菌BL2l/pET-d-ldh表达产物D-ldh的酶活力，测定到重组菌BL21/pET-d-ldh粗酶液中D-ldh的酶活力为31U/mL，而在菌株BL21/pET中测定不到酶活。对重组菌BL21/pET-d-ldh表达的D．乳酸脱氢酶的酶学特性研究显示，其催化反应最适pH为5.6～6.0，最适反应温度为30℃～35℃；再次，本实验构建了一个鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus，JCM1553)的置换型同源重组质粒pUC19-D1-CM-D2。将此质粒转化至鼠李糖乳杆菌中能与菌株染色体上的D-ldh基因进行同源双交换，通过质粒pUC19-D1-CM-D2中氯霉素抗性标记进行筛选，期望能得到D-ldh基因缺陷的突变株，从而获得产高光学纯度L．乳酸的鼠李糖乳杆菌。

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作者
卢福芝;
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作者单位

广西大学;

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授予单位广西大学;
学科生物化工
授予学位硕士
导师姓名黄日波;
年度 2010
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 Q939.117;
关键词
鼠李糖乳杆菌; D-乳酸脱氢酶; 大肠杆菌; 克隆表达; 同源重组质粒;

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