大斑刚毛座腔菌漆酶基因功能验证及高产漆酶发酵条件优化

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摘要

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1 引言

1．1 漆酶与玉米大斑病的关系

1．2 真菌漆酶简介

1．3 漆酶的应用

1．4 本论文的研究内容和意义

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂及其配制

2．1．4 仪器和设备

2．2 漆酶同工酶基因的表达量分析

2．2．1 漆酶基因的克隆

2．2．2 漆酶基因在病菌侵染过程中不同时期的表达量分析

2．2．3 在不同诱导剂诱导下的表达量分析

2．3 StLAC1和StLAC2基因回复突变体的创制

2．3．1 StLAC1和StLAC2基因重组质粒的构建

2．3．2 StLAC1(StLAC2)基因回复突变体的获得

2．3．3 转化子的Southern blotting验证

2．4 StLAC1基因回复突变体分析

2．4．1 突变菌株生长发育分析

2．4．2 漆酶活性测定

2．4．3 胞内黑色素分析

2．4．4 StLAC1基因缺失与菌株附着胞膨压的关系

2．4．5 渗透调节能力分析

2．5 StLAC2基因的回复突变体分析

2．5．1 突变体生理生化分析

2．5．2 突变体疏水性测定

2．5．3 突变体细胞壁完整性测定和细胞壁观察

2．5．4 突变菌株的组织病理学分析

2．6 StLAC1、StLAC2双基因敲除转化子的创制

2．6．1 StLAC1、StLAC2双基因敲除载体的构建

2．6．2 StLAC2基因同源片段的PCR扩增

2．6．3 目的片段与目标载体的连接

2．6．4 StLAC1、StLAC2双基因敲除转化子的获得

2．7 大斑刚毛座腔菌漆酶的发酵条件和酶学性质

2．7．1 发酵基本条件

2．7．2 单因素试验优化

2．7．3 响应面优化试验设计

2．7．4 漆酶活力测定

2．7．5 漆酶酶学性质分析

3 结果与分析

3．1 大斑刚毛座腔菌漆酶家族基因的表达规律

3．1．1 漆酶基因的克隆

3．1．2 漆酶基因在生长发育及侵染过程中的表达量

3．1．3 不同漆酶基因在外源刺激物作用下的表达量

3．2 StLAC1和StLAC2基因的回复突变体

3．2．1 基因回复突变载体的构建

3．3 回复突变体StLAC1基因的分析

3．3．1 病菌生长发育

3．3．2 黑色素合成

3．3．3 附着胞形成和穿透能力

3．3．4 病菌细胞壁的孔径

3．3．5 附着胞膨压

3．3．6 致病性

3．3．7 其它漆酶基因在StLAC1基因缺失突变体中转录水平

3．4 回复突变体StLAC2基因的功能分析

3．4．1 病菌生长发育分析

3．4．2 StLAC2基因回复突变体的产孢能力

3．4．3 漆酶活性

3．4．4 黑色素合成

3．4．5 病菌的细胞壁完整性

3．4．6 病菌菌丝细胞壁的疏水性

3．4．7 玻璃纸穿透能力

3．4．8 StLAC2基因回复突变体的组织病理学观察

3．4．9 StLAC2基因回复突变体的抗渗透胁迫能力分析

3．5 StLAC1、StLAC2双基因敲除转化子的创制及分析

3．6 大斑刚毛座腔菌漆酶的发酵条件和酶学性质

3．6．1 发酵产酶曲线

3．6．2 漆酶分泌条件的单因素试验

3．6．3 响应面分析试验

3．6．4 漆酶酶学性质研究

4 讨论

4．1 真菌中漆酶基因与其生长、发育、侵染和致病性的关系

4．2 漆酶的发酵工艺与漆酶的工业化前景

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢