LPS致流产作用及保胎中药的调控效应研究

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繁殖障碍是使家畜繁殖力降低的主要原因,引起繁殖障碍的重要原因之一就是流产。哺乳动物尤其是反刍家畜又以妊娠早期的胚胎丢失几率最高。流产不仅造成胎儿夭折和母畜产奶量损失,延长母畜产仔间隔,而且常常引起胎衣滞留,造成子宫内膜炎,及母畜的习惯性流产,甚至使母畜失去繁殖性能,直接影响家畜的繁殖、品种的改良,给国家和企业造成巨大的经济损失,已经引起人们的高度重视。内毒素(感染或水平上升)是造成流产的一个重要原因,故本研究运用LPS建立小鼠肠道和肝脏损伤、流产和胚胎着床障碍的三种模型,并结合体外细胞培养的方法,探讨内毒素对肝脏的损伤机制及肝脏对内毒素的清除,同时研究LPS诱导小鼠流产和着床障碍的分子机制以及保胎中药的作用机理,为阐明LPS与妊娠母胎界面的免疫关系,寻找能够有效预防和调控妊娠早期胚胎丢失的药物并探索其作用机制,从而减少流产在动物生产中的发生,提高母畜的繁殖力和畜牧业养殖的经济效益。
　　通过对LPS致小鼠肝损伤模型进行研究,发现LPS导致肠道的通透性增加,肠黏膜紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达降低,推测破坏肠黏膜机械屏障可能是LPS对肠黏膜屏障损伤的重要机制之一。同时腹腔注射LPS引起回肠ROS大量蓄积,提示ROS可能参与调节LPS引发的肠黏膜屏障损伤过程。LPS处理组小鼠血清中的ALT/AST显著升高,说明肝细胞受损,肝功能下降。肝脏MDA含量剧增,抗氧化酶SOD、CAT、GPx活性明显降低,意味着LPS引起肝脏ROS的大量蓄积,并引起了脂质过氧化损伤。通过DHE荧光法检测发现LPS同样能引起人肝癌细胞HepG2产生大量的ROS,这一点与体内试验结果一致。同时LPS导致小鼠血中有大量的NO,肝脏的TNF-α、KC的含量明显升高,KCmRNA表达显著升高,肝脏的iNOS蛋白和肝细胞核内的NF-κB表达上升。LPS刺激HepG2之后能使其分泌大量的IL-8,且通过免疫荧光染色发现胞浆中静态的NF-κB被激活,转位于细胞核,参与调节趋化因子IL-8(或KC)的转录。LPS处理24h后,血清中内毒素水平仍明显高于对照组,说明受损的肝脏尚未能彻底清除血液中的内毒素,另一方面肠道通透性增加有可能导致肠腔内大量的内毒素被吸收入血。
　　对LPS诱导孕鼠流产模型研究发现,LPS可显著减低孕鼠的子宫重量和子宫局部的Th2型细胞因子(IL-4和IL-10)含量,升高子宫Th1型细胞因子(主要是IFN-γ,对IL-2作用不明显)含量,使母-胎界面的Th1/Th2细胞因子平衡向着Th1方向偏移,同时诱导子宫内膜内的CD4+T细胞和F4/80巨噬细胞大量聚集,但基本不影响CD8+T细胞的含量。预口服保胎无忧散、泰山磐石散和白术散三种中药方剂的水煎液能调节子宫微环境,提高子宫重量,抑制Th1型细胞因子的分泌,提高Th2型细胞因子的水平,还能显著降低LPS引起的CD4+T细胞和巨噬细胞的增加,同时使子宫CD8+T细胞的数量显著增加,从而调节Th1/Th2的免疫平衡,使其向着有利于正常妊娠的方向发展,显著降低了孕鼠的流产率和胚胎吸收率,并对LPS造成的子宫损伤有一定的修复作用。
　　采用孕3d小鼠腹腔注射LPS的方法成功建立胚胎着床障碍模型。研究发现,LPS处理后,小鼠血清和子宫组织中NOS活性明显增加,子宫中IFN-γ含量显著上升、IL-10含量无显著变化,且呈剂量依赖性,使Th1/Th2平衡向Th1反应方向移动,因此改变了着床期小鼠子宫免疫微环境,导致了胚胎着床障碍。口服0.5mg或1mg黄芩苷或槲皮素均能明显拮抗LPS诱导的着床障碍,使平均着床胚胎数显著上升,着床率升高。黄芩苷显著抑制LPS引起的子宫组织中IFN-γ水平的上升,提高子宫IL-10的含量,降低子宫和血清的NOS活性,从而减少NO的过量合成,使其接近于正常妊娠状态。以上结果在LPS处理的体外培养着床期小鼠子宫内膜细胞的模型中,也得到证实。此外槲皮素能通过显著抑制LPS诱导的子宫IFN-γmRNA的高表达,上调子宫组织中TGF-β1mRNA的表达来调节子宫局部的免疫平衡。黄芩苷和槲皮素均调节子宫局部的免疫平衡,使其向着有利于妊娠建立的Th2反应偏移,发挥保胎促孕功效。
　　综上,LPS通过导致肠道紧密连接蛋白表达降低,肠黏膜屏障受损,引发内毒素血症。大量的LPS刺激Kupffer细胞和肝细胞,产生大量ROS,抗氧化酶活性降低,激活NF-κB,产生大量的炎性介质,加重了肝损伤,清除内毒素的能力下降。LPS诱导的孕鼠流产和着床障碍,主要是通过破坏母胎界面的Th1/Th2免疫平衡状态;而中药方剂和中药成分能够显著拮抗LPS的破坏作用,改善和修复子宫的免疫平衡,使其有利于正常妊娠和着床,发挥其保胎促孕功效。

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作者
赵延涛;
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作者单位

河北农业大学;

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授予单位河北农业大学;
学科动物遗传育种与繁殖
授予学位博士
导师姓名钟秀会;
年度 2011
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类畜禽繁殖;中兽医药物学;
关键词
内毒素; 致流产作用; LPS脂多糖; 保胎中药; 细胞因子; 调控效应;

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