丙酸睾酮改善老年大鼠的协调运动行为及VMAT2的参与

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本研究通过网格棒下降实验(Descending a wire mesh pole)、楔形板行走实验(Tapered beam walking test)和粘附物去除实验(Adhesiveremoval test)，检测鼻腔(Intranasal administration)或皮下(Subcutaneousinjection)给予TP对大鼠协调运动行为的影响;通过液质联用技术检测鼻腔或皮下给予TP对大鼠尾壳核内DA及其代谢产物含量的影响;通过RT-PCR技术，免疫印迹以及免疫细胞化学检测鼻腔或皮下给予TP对大鼠黑质-纹状体多巴胺能体系中VMAT2表达的影响;通过给予VMAT2阻断剂利血平，探讨TP对上述指标的影响是否与VMAT2相关;在细胞水平探讨TP对多巴胺能神经元保护作用机制是否通过雄激素受体途径实现的。
　　本文主要分五部分展开研究：
　　第一部分丙酸睾酮改善老年大鼠的协调运动行为
　　目的:探讨长期鼻腔或皮下TP替代对大鼠协调运动行为的影响。
　　方法:通过网格棒下降、楔形板行走和粘附物去除实验检测大鼠协同运动行为。
　　结果:1.通过网格棒下降实验发现，24Mon大鼠网格棒停留时间较6Mon大鼠短(P＜0.01);长期TP处理后老年大鼠停留时间较24Mon组延长（鼻腔95.21％、皮下55.02％）(P＜0.01)差异显著。
　　2.通过楔形板行走实验发现，24Mon大鼠双后肢楔形板评分较6Mon大鼠高(P＜0.01);长期TP处理后老年大鼠双后肢评分较24Mon组降低（左后肢，鼻腔22.56％、皮下11.24％;右后肢，鼻腔19.33％、皮下13.32％）（P＜0.01）。
　　3.通过粘附物去除实验发现，24Mon组大鼠鼻左、右侧粘附物去除时间较6Mon大鼠长(P＜0.01);长期TP处理后老年大鼠鼻部双侧粘附物去除时间较24Mon组缩短（左侧:鼻腔39.29％、皮下38.29％;右侧:鼻腔50.11％、皮下40.64％）(P＜0.01)。24Mon组大鼠两前肢粘附物去除时间较6Mon大鼠长(P＜0.01);长期TP处理后老年大鼠两前肢粘附物去除时间分别较24Mon组缩短（左侧:鼻腔48.31％、皮下57.63％;右侧:鼻腔49.81％、皮下61.34％）(P＜0.01)。
　　结论:1.老年大鼠表现协调运动行为缺陷。
　　2.老年大鼠长期给予TP替代后，协调运动行为缺陷改善。
　　3.老年大鼠鼻腔给予TP对协调运动行为缺陷的改善优于皮下给药。
　　第二部分丙酸睾酮增强老年大鼠黑质-纹状体多巴胺能神经元的功能活动
　　目的:探讨长期鼻腔或皮下TP替代对大鼠尾壳核DA及其代谢产物含量的影响。
　　方法:通过液质联用技术检测大鼠尾壳核内DA及其代谢产物的含量。
　　结果:24Mon组大鼠CPu处DA及其代谢产物水平均较6Mon组明显改变，DA、DOPAC和HVA含量(P＜0.01)明显降低;DOPAC+HVA/DA、DOPAC/DA和HVA/DA比值（P＜0.01）明显升高;给予TP长期处理后，老年大鼠DA及其代谢产物含量均较24Mon组明显改变，其中DA（鼻腔131.46％、皮下53.87％）、DOPAC（鼻腔38.24％、皮下27.82％）和HVA（鼻腔33.25％、皮下15.79％）(P＜0.01)明显升高;DOPAC+HVA/DA（鼻腔35.79％、皮下18.61％）、DOPAC/DA（鼻腔35.24％、皮下16.48％）和HVA/DA（鼻腔37.26％、皮下24.07％）(P＜0.01)明显降低，鼻腔给药组基本恢复到6Mon组水平(P＞0.05)。
　　结论:1.老年大鼠尾壳核内多巴胺神经递质及其代谢产物含量减少。
　　2.老年大鼠长期TP替代后，尾壳核内多巴胺神经递质及其代谢产物含量增加，暗示黑质-纹状体多巴胺能神经元的活性增强。
　　3.老年大鼠鼻腔给予TP对尾壳核内DA及其代谢产物含量的改善优于皮下给药。
　　第三部分丙酸睾酮增加老年大鼠黑质-纹状体多巴胺能神经元VMAT2的表达
　　目的:探讨长期鼻腔或皮下TP替代对老年大鼠黑质-纹状体多巴胺能神经元VMAT2表达的影响。
　　方法:通过RT-PCR检测大鼠黑质内VMAT2 mRNA的RQ值，Westernblot检测大鼠黑质和尾壳核内VMAT2/GAPDH的比值，免疫组化法检测老年大鼠黑质和尾壳核内VMAT2的平均光密度值和神经元数目。
　　结论:
　　1.老年大鼠黑质内VMAT2-ir免疫阳性细胞数目减少，给予TP后增加。
　　2.老年大鼠黑质-纹状体多巴胺能神经元VMAT2 mRNA和VMAT2蛋白表达减少。
　　3.老年大鼠长期给予TP替代后，能够在转录和翻译水平提高黑质-纹状体多巴胺能神经元VMAT2表达。
　　4.老年大鼠鼻腔给予TP对黑质-纹状体多巴胺能神经元VMAT2的改善优于皮下给药。
　　第四部分 VMAT2参与丙酸睾酮对老年大鼠的协调运动行为和黑质-纹状体多巴胺能神经元功能活动的改善
　　目的:探讨老年大鼠TP长期替代后协调运动行为和黑质-纹状体多巴胺能神经元的功能活动明显改善，是否与VMAT2表达增多相关。
　　方法:应用VMAT2长效特异性抑制剂利血平预先处理老年大鼠，然后给予TP皮下替代治疗。通过网格棒下降，楔形板行走和粘附物去除实验检测大鼠协同运动行为，液质联用技术检测大鼠尾壳核内DA及其代谢产物的水平，RT-PCR检测大鼠黑质内VMAT2 mRNA的RQ值，Western blot检测大鼠黑质和尾壳核内VMAT2/GAPDH的比值。
　　结论:1.利血平抑制VMAT2的功能、减少DA及其代谢产物的含量、提高DA代谢产物与DA的比值和损伤协调运动行为。
　　2.TP对老年大鼠协调运动行为和黑质-纹状体多巴胺能神经元功能的影响可能部分通过VMAT2实现的。
　　第五部分睾酮提高SH-SY5Y细胞MAT2表达与雄激素受体相关
　　目的:在细胞水平探讨睾酮(Testosterone，T)提高VMAT2表达和神经保护作用是通过雄激素受体(Androgen receptor，AR)实现的
　　方法:RA/TPA分化的SH-SY5Y细胞作为DA神经元体外研究模型;利用H2O2作为ROS激发剂;预先给予T和AR阻断剂氟他胺(Flutamide，Flu)处理，通过MTT和LDH检测SH-SY5Y细胞损伤程度，通过免疫荧光和免疫印记检测VMAT2表达的变化。
　　结果:1.RA/TPA分化SH-SY5Y细胞后，出现胞体变圆变小，突起增长等形态学变化。NeuN检测结果显示RA/TPA分化细胞NeuN的表达明显（P＜0.01）高于未分化细胞。
　　2.MTT和LDH检测结果显示，对照(Con)组、睾酮处理(T)组和睾酮和氟他胺处理(T+F)组三组间细胞活性没有明显变化(P＞0.05)，过氧化氢处理(H)组、睾酮和过氧化氢处理(T+H)组和睾酮、氟他胺和过氧化氢处理(T+F+H)组三组细胞活性均较Con、T和T+F三组降低(P＜0.01)，H和T+F+H组细胞活性低于T+H组(P＜0.01)。
　　3.免疫荧光结果显示:Con和T+F组间AOD值没有明显差异(P＞0.05)，H、T和T+F+H三组间AOD值没有明显差异(P＞0.05)，H、T和T+F+H三组的AOD值明显高于Con和T+F组(P＜0.01)，T+H组明显高于其余5组（P＜0.01）。
　　4.免疫印记结果显示:Glyco-VMAT2与GAPDH免疫印迹条带相对吸光度比值，H、T和T+F+H三组间没有明显差异(P＞0.05)，H、T和T+F+H三组间明显高于Con和T+F组（P＜0.01），T+H组明显高于其余5组(P＜0.01)。Partially glyco-VMAT2和Native-VMAT2与GAPDH免疫印迹条带相对吸光度比值，Con、H、T、T+F+H和T+F五组间均无统计学意义（P＞0.05），T+H组明显高于其余5组(P＜0.01)。
　　结论:1.睾酮对H2O2损伤SH-SY5Y细胞的神经保护作用部分通过AR实现的。
　　2.睾酮使SH-SY5Y细胞VMAT2表达提高部分通过AR实现的。
　　3.氧化应激能够通过非AR途径提高VMAT2表达。

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作者
王力;
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作者单位

河北医科大学;

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授予单位河北医科大学;
学科人体解剖与组织胚胎学
授予学位博士
导师姓名石葛明;
年度 2015
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R977.12;
关键词
丙酸睾酮; 协调运动行为; 囊泡单胺转运体2; 多巴胺; 神经保护作用;

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