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极长链脂肪酸与2型糖尿病大鼠脑Aβ生成的关系研究

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综述 过氧化物酶体功能异常与阿尔茨海默病

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摘要

目的:阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种慢性神经系统退行性疾病，以进行性记忆和认知功能减退为主要临床表现。AD的特征性病理改变为β-淀粉样蛋白(amyloid protein，Aβ)在神经细胞外沉积形成老年斑。Aβ是AD的主要致病因素。AD不仅是老年人常见的疾病，也是糖尿病(diabetes mellitus，DM)病人高发的疾病。这对糖尿病病人无疑是雪上添霜。因此，亟待弄清糖尿病病人高发AD的原因，找到干预措施。
　　基于以下两个事实:(1)报道显示，AD病人脑中极长链脂肪酸(verylong chain fatty acids，VLCFA.，≥C22)水平增加。VLCFA对神经细胞具有脂毒性，可以导致细胞活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产生增多，氧化应激增强。而氧化应激是目前公认的Aβ生成增多的重要机制之一。(2)糖尿病是糖脂代谢紊乱疾病。我们假设，在糖尿病状态下，脂代谢的紊乱会使脑中的VLCFA聚集，进而引起氧化应激，使Aβ异常生成增加，最终导致认知障碍，糖尿病AD发生。
　　为了证实此假设，本实验用高脂饮食加小剂量STZ的方法诱导2型糖尿病的大鼠模型，观察2型糖尿病大鼠的学习记忆情况，以及脑中Aβ的生成、氧化应激水平和VLCFA的变化，探讨VLCFA在2型糖尿病大鼠脑Aβ生成中的作用，为预防及治疗糖尿病AD提供新的实验依据。
　　方法:
　　1实验动物
　　以本实验室侯连国等人制备的2型糖尿病大鼠的脑组织为实验材料。实验动物分为对照组(Con)和2型糖尿病组(DM)。
　　2 Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力
　　用上海吉量软件科技有限公司Morris水迷宫，采用定位航行试验和空间探索试验，分别记录大鼠的平均逃避潜伏期、穿越原平台位置的次数和第一次到达原平台的时间，以评估大鼠的学习记忆能力。
　　3 ELISA检测脑组织Aβ40、BACE1的含量
　　用日本IBL公司ELISA试剂盒进行测定，脑Aβ40的含量以pg/mgprotein表示;脑BACE1的含量以ng/μgprotein表示。
　　4实时定量PCR检测脑APP和BACE1的mRNA表达
　　用美国OMEGA公司总RNA提取试剂盒提取大鼠脑组织总RNA。以18S rRNA做内参，实时定量PCR测定APP、BACE1 mRNA的相对表达量。
　　5免疫组织化学分析脑组织APP的蛋白水平
　　对大鼠脑组织石蜡切片进行免疫组织化学染色，分析APP的蛋白表达水平。
　　6气相色谱分析脑组织VLCFA
　　提取各组大鼠脑组织脂肪酸，用日本岛津公司气相色谱仪(GC-2010Plus)分析每种VLCFA的含量。
　　7 TBA法测定脑组织丙二醛(MDA)含量
　　采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法进行测定，脑MDA的含量以nmol/mgprot表示。
　　8 Western blot检测NOX4，p47和HO-1的蛋白表达
　　提取大鼠脑组织总蛋白，Western blot测定NOX4，p47和HO-1蛋白的相对表达量。
　　9数据处理
　　实验数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析，对测定结果进行正态性与方差齐性检验，数据用x±SD表示。逃避潜伏期数据采用重复测量的方差分析(One-way repeated measures ANOVA)进行统计，其它数据采用Student'st检验分析两组之间均数的统计学差异。以P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　结果:
　　1 DM大鼠的学习记忆能力下降
　　与Con组相比，虽然DM组大鼠第一天的逃避潜伏期有所延长，但随后几天均没有明显差异。DM组大鼠，与Con组相比，穿越原平台次数明显减少，第一次到达原平台时间明显延长，差异有统计学意义(P＜0.01)。表明，2型糖尿病大鼠的学习记忆能力下降。
　　2 DM大鼠脑中Aβ生成增加
　　2.1脑组织Aβ的含量
　　ELISA结果显示，Con组和DM组大鼠脑组织Aβ40含量分别为:Con(4.87±0.71 pg/mg protein)，DM(6.22±0.81 pg/mg protein)。DM组脑组织Aβ含量较Con组明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。表明，糖尿病大鼠脑Aβ水平增加。
　　2.2脑组织APP的表达
　　实时定量PCR结果显示，DM组脑组织APP mRNA的表达水平(0.046±0.014)较Con组(0.025±0.007)明显升高，差异有统计学意义(P＜0.001)。
　　免疫组化结果显示，DM组脑组织中APP阳性细胞数量、着色深度较Con组明显增加;图像分析显示，DM组大鼠脑中APP阳性细胞的平均光密度值较Con组显著升高，差异有统计学意义(P＜0.001)。
　　表明，糖尿病大鼠脑APP的mRNA和蛋白表达均增加。
　　2.3脑组织BACE1的表达
　　实时定量PCR结果显示，DM组脑组织BACE1 mRNA的表达水平(0.912±0.038)较Con组(0.661±0.118)明显升高，差异有统计学意义(P＜0.001)。
　　ELISA结果显示，DM组脑组织BACE1的含量(0.95±0.09 ng/μgprotein)较Con组(0.78±0.06 ng/μg protein)明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　表明，糖尿病大鼠脑BACE1的mRNA和蛋白表达均增加。
　　以上结果表明，糖尿病大鼠脑中APP的β-分泌酶裂解途径上调，从而导致Aβ生成增加，出现类似AD的病理改变。
　　3 DM大鼠脑中C26∶0水平增加
　　气相色谱结果显示，DM组C26∶0水平(44.90±13.94μmol/g tissue)较Con组(18.38±6.29μmol/g tissue)显著升高，差异有统计学意义(P＜0.001); C22∶0、C24∶0含量在DM组与Con组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。表明，糖尿病大鼠脑极长链脂肪酸C26∶0水平增加。
　　4 DM大鼠脑中C26∶0水平与Aβ含量呈正相关
　　相关分析结果显示，脑组织C26∶0水平与Aβ含量呈正相关(r=0.557，P=0.016)。表明，糖尿病大鼠脑C26∶0水平增加与Aβ生成增加有关。5 DM大鼠脑氧化应激增强
　　TBA结果显示，DM组脑组织MDA的含量(2.19±0.27 nmol/mgprotein)较Con组(1.83±0.19 nmol/mg protein)明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　Western blot结果显示，DM组大鼠脑组织氧化应激指标NOX4，p47和HO-1的蛋白表达水平均高于Con组。
　　表明，糖尿病大鼠脑氧化应激水平增强。
　　6 DM大鼠脑中C26∶0水平与MDA含量呈正相关
　　相关分析结果显示，脑组织C26∶0水平与MDA含量呈正相关(r=0.504，P=0.033)。表明，糖尿病大鼠脑C26∶0水平增加与氧化应激水平增强有关。
　　结论:
　　12型糖尿病大鼠的认知功能障碍与脑中C26∶0增加所引起的Aβ增加有关。
　　2 Aβ的增加与氧化应激引起的APP和BACE1的表达上调有关。

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