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【6h】

99Tcm标记EGFR mRNA反义肽核酸荷瘤卵巢癌基因显像的研究

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目的:研究99Tcm标记表皮生长因子受体(Epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)mRNA反义肽核酸(peptidenucleicacid，PNA)行EGFR基因分子探针的制备，测定其标记率及放化纯，评价其在体内外的稳定性，并探讨其在EGFRmRNA表达阳性卵巢癌荷瘤裸鼠体内分布及体内显像的情况，以探索核素基因显像在活体内评价肿瘤基因表达状况，为肿瘤早期特异诊断和靶向治疗及疗效评价提供新的分子影像学方法。
　　 方法:针对EGFRmRNA（genbank序列号:NM_201283.1）的第503-519碱基序列(17bp)，设计反义PNA5'-AATGAGGACATAACCAG-3'及无义PNA5'-AGTAGAGATGTGACGAT-3'，将4个氨基酸(Gly-(D)-Ala-Gly-Gly)连接在其5'端，此四个氨基酸可形成一个类似N4结构的强螯合基团，在PNA与四个氨基酸之间再引入一个隔离物γ-氨基丁酸(4-amino-butyricacid，Aba)以消除空间障碍，然后用核素99Tcm进行标记。用高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography,HPLC）测定两种探针的标记率及放化纯，并分别测定其在室温下静置、与生理盐水及人新鲜血清1∶1混合置于37℃水浴箱中1、2、4、6、12、24h的放化纯以分析其在体外的稳定性;收集了注射99Tcm-EGFRmRNA反义及无义PNA探针荷瘤裸鼠30min及2-3h尿液，用HPLC测定其标记率以了解其在荷瘤裸鼠体内的稳定性。采用静置贴壁法培养人卵巢癌SKOV3细胞，收集对数生长期的人卵巢癌SKOV3细胞，调配成浓度为3×106个/ml加入到六孔板中，6×105个细胞/每孔（200μL/孔），然后置于培养箱中进行培养。待细胞长满至整个孔的80％-90％后，换新鲜培养基，然后加入30μL(37kBq)稀释好的反义或无义PNA溶液，再置于培养箱中分别培养1、2、4、6、12、24h后收集其上清及沉淀，测定其放射性计数，计算不同时间的摄取率并比较有无差异。将稀释好的30μL99Tcm-EGFRmRNA反义或无义PNA(37kBq)加入到SKOV3细胞的每个培养孔内（6×105个/孔），分别在培养箱内培养6h后，迅速移去培养基并换成新鲜培养基，再置于培养箱中继续培养至1、2、4、6、12、24小时收集每孔的上清及沉淀，并测定其放射性计数。计算不同时刻的细胞滞留率，初步探讨两种探针在人卵巢癌SKOV3细胞中的药代动力学。采用逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscriptasePolymeraseChainReaction，RT-PCR)测定人卵巢癌SKOV3细胞中EGFRmRNA的表达情况。收集对数生长期的人卵巢癌SKOV3细胞，调配成浓度为3.0×107个细胞/mlRPIM1640培养基（不含胎牛血清）的单细胞悬液，注射于裸鼠右前肢皮下，每只裸鼠注射体积为0.2ml（6×106个细胞）。待肿瘤长到1-1.5cm时，选取肿瘤形态规则，色泽红润，大小无显著性差异的荷瘤小鼠用于实验。对比分析了分子探针在荷人卵巢癌SKOV3裸鼠体内分布及基因显像情况，抽取荷人卵巢癌SKOV3裸鼠48只，随机分为反义及无义两组，每组24只，每组再分为1、2、4、6h四个亚组，每个亚组6只，分别经尾静脉注射99Tcm-EGFRmRNA反义或无义PNA探针0.1ml(1110kBq)，分别于注射1、2、4、6h眼静脉采血后，断颈处死，取其心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺、胃、肠、脑、骨骼、肌肉及肿瘤等不同的组织或脏器，同时设置3个标准源，分别称重并测定不同时刻不同脏器的放射性计数及3个标准源放射性计数。计算每克组织中放射性计数占标准源总放射性计数（3个标准源的平均值）的比值(％ID/g)，比较两者间差异。再抽取荷人卵巢癌SKOV3裸鼠10只，随机分为反义及无义两组，每组5只，分别注射99Tcm标记的两种探针后，在1、2、4、6、8、10h进行静态显像，分别观察两组显像荷瘤裸鼠肿瘤放射性浓聚程度随时间变化的情况。计算不同时刻肿瘤部位放射性计数与对侧正常部位放射性计数比值(T/NT)。采用SAS9.1统计软件对实验数据进行统计学分析，所有实验结果的组间比较均采用两个样本的t检验，如果任何一组数据不符合正太性(p＜0.1)或者方差不齐(p＜0.1)，则采取成组设计两样本比较的秩和检验，以p＜0.05表示差异有统计学意义。
　　 结果:在设定的HPLC条件下，99Tcm-EGFRmRNA反义或无义PNA呈单峰，保留时间为12.5min，其在室温下6h内标记率分别为98.80％±1.14％、98.63±1.36％(n=6)，放化纯不低于95％;两种探针分别与生理盐水、人新鲜血清混合后6h，标记物的放化纯大于93％，甚至在混合后24h，其放化纯仍达到85％;收集注射了两种标记探针裸鼠的尿液后，经HPLC测定，注射了99Tcm标记反义探针后30min的尿液呈单峰，保留时间为12.5min，其注射后2-3h的尿液放化纯仍达到89％。
　　 人卵巢癌SKOV3细胞对99Tcm-EGFRmRNA反义及无义PNA的摄取率在1-6h随时间延长逐渐上升，随后逐渐下降，即6h细胞摄取率达到高峰，但99Tcm-EGFRmRNA反义PNA在各个时间点的细胞摄取率均高于99Tcm-EGFRmRNA无义PNA(P＜0.05);而两种探针的细胞滞留率随时间延长均逐渐下降，99Tcm-EGFRmRNA无义PNA的细胞滞留率在1-24h内均低于99Tcm-EGFRmRNA反义PNA(P＜0.05)。
　　 RT-PCR结果表明，人卵巢癌SKOV3细胞中EGFRmRNA高表达。
　　 荷人卵巢癌SKOV3裸鼠体内分布结果显示99Tcm-EGFRmRNA反义或无义PNA在荷人卵巢癌SKOV3裸鼠体内的放射性分布除肿瘤外主要集中在肝脏和肾脏。尾静脉注射99Tcm-EGFRmRNA反义PNA后1-6h，肿瘤摄取随时间延长逐渐增高，明显高于肌肉组织，而注射99Tcm-EGFRmRNA无义PNA后1-6h，肿瘤摄取随时间延长逐渐降低;注射后任意时刻，肿瘤对99Tcm-EGFRmRNA反义PNA的摄取均高于99Tcm-EGFRmRNA无义PNA(P＜0.05)。
　　 荷瘤裸鼠体内基因显像结果显示，注射99Tcm-EGFRmRNA反义PNA后1h，肿瘤部位可见放射性核素浓聚，且在注射后1-6h，肿瘤放射性浓聚程度随时间延长越来越明显;而注射99Tcm-EGFRmRNA无义PNA的任一时刻，肿瘤部位均未见明显显影;反义组显像裸鼠的T/NT比值在显像的各个时间点均高于无义组(P＜0.05)。
　　 结论:99Tcm-EGFRmRNA反义PNA用四个氨基酸短肽作为螯合剂标记的分子探针其标记率及放化纯均较高，体内外稳定性好，用于体内显像能特异性的聚集在EGFR高表达的肿瘤组织中，可作为一种有潜力的核素分子探针用于EGFRmRNA基因表达阳性的卵巢癌等肿瘤显像诊断，并可评价肿瘤EGFR表达状况。

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