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重组表达载体pSELECT-GFPzeo-rhBMP2转染兔骨髓充质干细胞生物学特性研究

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重组表达载体pSELECT-GFPzeo-rhBMP2转染兔骨髓间充质干细胞生物学特性研究

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结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 骨髓间充质干细胞在医学领域中的研究

参考文献

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摘要

目的：了解体外培养的兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)一般生物学特性；构建带有BMP-2基因的绿色荧光蛋白真核表达载体，将其转染兔BMSCs，通过筛选获得高效表达BMP-2的兔BMSCs，为后期骨组织工程动物试验奠定基础。
　　 方法：
　　 1.选择健康新西兰白兔，冬眠灵0.5ml肌肉注射麻醉，于胫骨行骨髓穿刺，抽取兔骨髓约5ml，采用全骨髓培养法对兔BMSCs进行体外原代培养获得纯度较高的兔BMSCs。对兔BMSCs进行形态学观察，绘制生长曲线，分析兔BMSCs生长规律；选用抗CD44单克隆抗体，应用免疫细胞化学法对培养的兔BMSCs进行表型鉴定。
　　 2.在已有含人BMP2全编码区序列的重组克隆载体pTA2-rhBMP2的基础上用BamHI和NheI双酶切pTA2-rhBMP2获得rhBMP2基因，将所得目的基因片断插入表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS并转化大肠杆菌DH5a，PCR、酶切鉴定并测序。
　　 3.按照LipofectmineTM2000 Reagent说明书，分别用上述空环状质粒表达载体和重组表达载体转染兔BMSCs，有限稀释法筛选阳性表达兔BMSCS。
　　 4.经RT-PCR证实兔BMSCs中目的基因的表达，采用免疫荧光化学法和Western Blot法鉴定兔BMSCs中rhBMP2重组蛋白表达。
　　 结果：
　　 1.兔BMSCs原代培养和形态学观察：培养的兔BMSCs黏附贴壁生长，呈长梭形、三角形或多角形，并有多个突起，存活率达90％以上，经多次传代仍能保持正常形态和功能；传代培养的兔BMSCs潜伏期为1～2d，对数增殖期为3～6d，接种后7～8d达顶峰，而后进入平台期，细胞增殖减慢；冻存复苏后细胞生长特性无明显改变；免疫细胞化学染色结果显示，CD44阳性表达率达95％，呈棕褐色，细胞表型稳定。
　　 2.重组表达载体pSELECT-GFPzeo-rhBMP2经双酶切可得到约1216bp的DNA片断，测序证实与Genebank中BMP2序列完全相符；用脂质体法将重组表达载体转染兔BMSCs细胞48～72h后，荧光显微镜下观察证实转染成功，经RT-PCR证实目的基因在转染载体中表达。采用免疫荧光化学方法和Western Blot方法检测到目的基因的蛋白表达。重组真核表达载体pSELECT-GFPzeo-rhBMP2转染兔BMSCs后，细胞能稳定表达rhBMP2，rhBMP2分子量约17kD。
　　 结论：
　　 1.在本培养体系下，可以得到纯化的兔骨髓间充质干细胞，所培养的兔BMSCs贴壁率高、体外生长状况良好、增殖能力强并可连续传代，适用于组织工程种子细胞库的建立。
　　 2.本研究成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核表达载体，thBMP2在兔BMSCs细胞中获得了有效表达，同时重组表达载体携有的绿色荧光标记，给thBMP2的体内外示踪定位提供了重要而方便的工具，为下一步开展动物实验提供了实验基础，并为组织工程临床应用提供了物质保障。

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