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生物破乳剂产生菌发酵工艺条件优化及调控策略

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生物破乳剂产生菌发酵工艺条件优化及调控策略

OPTIMIZATION OF FERMENTATIONCONDITION FORBIODEMULSIFIER-PRODUCING BACTERIUMAND ITS REGULATION STRATEGIES

摘 要

Abstract

第1章 绪 论

1.1 研究背景

1.2 国内外研究现状

1.3 课题研究的目的、意义及主要内容

第2章 试验材料与方法

2.1 试验材料与仪器

2.2试验方法

第3章 破乳菌筛选方法评价与筛选模式构建及破乳菌XH1的复壮

3.1 引言

3.2 生物破乳剂检测方法的对比分析

3.3 破乳菌高效筛选模式的构建原则

3.4 破乳菌菌种鉴定及其特性

3.5 菌株XH1破乳特性复壮

3.6 本章小结

第4章 破乳菌XH1破乳效能强化及有效成分分析

4.1 引言

4.2 烃类对破乳菌XH1的强化作用

4.3液体石蜡强化促进XH1破乳效能的作用机制

4.4 生物破乳剂粗产品的分离方法及定性分析

4.5本章小结

第5章 破乳菌XH1发酵工艺优化及动力学特征

5.1 引言

5.2 营养条件的优化

5.3 培养条件的优化

5.4 破乳菌XH1分批发酵过程特征

5.5 非结构化发酵动力学模型

5.6 破乳菌半连续式发酵工艺研究

5.7 本章小结

第6章 菌株XH1合成生物破乳剂的代谢调控策略

6.1 引言

6.2 破乳菌XH1 SDS-PAGE电泳差异蛋白质复合物条带的选择

6.3 差异表达蛋白复合物中蛋白质成分鉴定及功能解析

6.4生物破乳剂合成的调控策略

6.5本章小结

结 论

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

哈尔滨工业大学学位论文原创性声明

使用授权说明

致 谢

个人简历

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摘要

为满足“资源节约型、环境友好型”社会建设和绿色工业发展对绿色净水剂的需求,生物破乳剂作为一种高效、低毒、环保的绿色净水剂,成为破乳剂领域研究的新热点。在高含水原油乳状液以及其它工业乳状液副产品的处理和处置中,应用生物破乳剂替代大量使用的化学破乳剂,对提高乳状液脱水率,降低环境污染风险具有深远意义。但是,生物破乳剂的实际应用进程受到破乳剂产生菌代谢过程不稳定、破乳有效成分复杂及缺少大规模发酵生产经验等问题的制约。基于此,开展破乳菌筛选方法;菌种破乳效能强化;粗产品分离与鉴定;发酵工艺优化及产破乳剂相关蛋白质功能解析等方面的研究,将为生物破乳剂的大规模生产、推广和应用奠定良好基础。
　　将可用于间接表征生物破乳剂破乳效能及破乳菌初筛的6种生物表面活性剂检测方法与破乳试验相结合,提出破乳菌筛选原则,构建高效筛选模式。确定了高效破乳菌(24h排油率≥90％)的判断依据:发酵液表面张力≤40mN/m或细胞表面疏水性(MATH)≥50%。筛选得到7株高效破乳菌,经16S rDNA鉴定分属于芽孢杆菌属(Bacilllus sp.)和戈登氏菌属(Gordonia sp.),实验室编号分别为LXH-1、LXH-2、LXH-3、LL1、LL-1、LL-2和LL-3。
　　以生物破乳剂产生菌XH1为研究对象,改进破乳菌复壮方法,其核心是通过烃类物质-液体石蜡为底物排除负变细胞,调节菌株的破乳活性;改进的复壮方法可成功将菌株XH1的表面活性、破乳功能等特性恢复至原始水平,效果优于常规复壮。
　　研究表明烃类物质-液体石蜡对菌株XH1合成破乳有效组分具有刺激和促进作用,利用液体石蜡预先刺激强化菌种,再经生产培养基扩大培养,获得的生物破乳剂可将破乳半衰期t1/2从16h缩短为2h。根据胞外蛋白破乳比活性、细胞表面疏水性等相关试验结果,初步分析液体石蜡强化促进菌株XH1破乳特性的作用机制。
　　菌株XH1经液体石蜡强化后,破乳有效组分主要分布于上清液和附着在菌体表面。分离得到生物破乳剂粗产品,产量为2.01g/L,4mg的排油率(24hR.D.)>93%。利用可见-紫外光谱、红外光谱和薄层层析(TLC)确定粗产品主要功能组分为蛋白质和脂肽类物质;平均分子量为2.59×106Da。并从中粗提得到脂肽类物质的量为0.08±0.01g/g(24hR.D.:65.3%);破乳活性蛋白复合物可由饱和度25%,45%的(NH4)2SO4粗提得到,产量为0.36±0.02g/g(24hR.D.:67.4%)。利用SDS-PAGE电泳和质谱技术确定疏水蛋白质Oxalate Decarboxylase为一种破乳有效蛋白质。
　　为了提高生物破乳剂的产率,采用响应面法(RSM)确定最优培养基组成为:8.5g/L葡萄糖、3%(v/v)液体石蜡、15g/L磷酸盐(K2HPO4&KH2PO4)、1.5g/L酵母膏和3.36g/L氯化铵;与优化前相比排油率(24h)提高了35.5%,破乳剂粗产品产量提高了1倍。进一步确定最佳发酵条件为:培养温度29℃、摇床转速200r/min、培养时间21h和种子液菌龄24h。
　　为了确定破乳菌XH1的发酵方式,首先基于Logistic方程、Luedeking-Piret方程及Luedeking-Piret-Like方程建立描述菌株XH1分批发酵生产破乳剂的动力学模型,经检验该组模型能较好的拟合XH1发酵过程。进一步比较不同的发酵方式,结果表明分批补料半连续式发酵优于分批发酵,最佳补料参数:初始葡萄糖为2.0g/L;补料方式为间歇式,间隔时间为5h;补料量为:控制每次补料量比前一次增加0.02%～0.04%。破乳菌XH1在最佳补料方式下破乳剂粗产品产率提高55.9%,产品对糖得率提高44%,高效破乳剂(24h排油率>80%)连续生产周期延长了50h。
　　为了确定参与生物破乳剂合成的相关蛋白质,采用SDS-PAGE电泳研究液体石蜡刺激强化培养和单一营养物质缺失对XH1破乳效能和菌体总蛋白变化的影响,获得差异表达蛋白复合物Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。通过nano ESI-Q-TOFMS/MS共鉴定出66个差异表达蛋白质,分属于碳水化合物的转运和代谢、能量产生与转换、翻译/核糖体结构和生物合成等14个蛋白质功能。确定以上差异表达蛋白质中与糖酵解途径(EMP)、三羧酸循环(TCA)以及蛋白质合成相关的酶与菌株XH1合成蛋白质和脂肽类生物破乳剂关系密切,进一步从蛋白质组层面分析不同发酵条件影响菌株XH1产生物破乳剂能力的作用机制。
　　基于以上研究结果,建立发酵工艺条件、差异蛋白质功能以及生物破乳剂合成过程三者的关系,从代谢调节、菌种特性和发酵工艺三个层面综合分析强化破乳菌XH1产破乳剂能力的策略,并提出菌种高效筛选→菌种改进复壮→液体石蜡刺激强化→半连续发酵生产的破乳菌XH1发酵形式,对于今后生物破乳剂大规模生产具有重要的参考价值。

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