松弛素(relaxin)对石英尘致肺纤维化的拮抗作用及机制研究

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矽肺是世界上流行最广的职业病,也是我国危害最为严重的职业病之一。此病由长期大量吸入含游离二氧化硅的粉尘而引起,其后随着炎症细胞浸润、肺泡炎、成纤维细胞增生、矽结节形成,最终导致局部肺组织甚至是全肺纤维化。至今对矽肺纤维化发病机制的认识仍有限,也未找到治愈的方案。
　　松弛素自1926年被发现以来,一直被认为是一种可以重构细胞外基质的激素,主要作用于雌性动物生殖道起到利于分娩的效果。最近的研究表明它不仅是一种生殖相关激素,而且可以稳定缔组织内环境,在肺脏、心脏、肾脏、脑、皮肤组织等非生殖组织都起到了抗纤维化作用。采用人肺成纤维细胞的体外实验结果表明,外源性松弛素可以通过抑制胶原蛋白分泌和/或沉积和刺激金属基质蛋白酶表达减少基质的堆积,并抑制转化生长因子诱导的胶原蛋白和/或纤维连接蛋白的分泌。动物试验结果显示,敲除松弛素及其受体基因的小鼠肺脏内间质蛋白持续增多。此外,松弛素还可抑制小鼠模型中由博来霉素所致的纤维化病变,而这种纤维化病变的病理学特征与矽尘所致肺纤维化有某些相似性。上述研究表明,松弛素可作为一种潜在的药物用于抑制二氧化硅诱导的肺纤维化,然而松弛素在石英尘致矽肺形成中的作用目前尚不清楚。
　　本研究建立矽肺体内动物模型和体外细胞模型,并在此基础上运用苏木精-伊红染色,碱水解法,实时荧光定量PCR法、免疫组织化学法、明胶酶谱法和酶联免疫法等方法,观察矽肺动物模型中内源性松弛素的变化及外源性松弛素处理对矽肺体外细胞模型影响,以论证松弛素对肺纤维化的拮抗作用。本研究分为三部分:
　　第一部分大鼠矽肺形成过程中松弛素及其受体mRNA、蛋白表达及其细胞定位
　　目的:探讨松弛素(松弛素)及其受体在大鼠矽肺形成过程中的潜在作用。
　　方法:将64只Wistar大鼠随机分为2个实验组,即对照组、矽肺组。气管滴注二氧化硅(德国标准石英DQ12)粉尘悬液建立大鼠矽肺模型。模型建立后,分4个时间点(1d、7d、14d、28d),每组每个时间点分别取8只大鼠将其处死。以苏木精-伊红染色观察矽肺动物模型的病理变化,以碱水解法检测羟脯氨酸含量,实时荧光定量PCR法、免疫组织化学法分别检测矽肺形成过程中松弛素及其受体RXFP1等细胞因子基因和蛋白水平的表达。
　　结果:
　　(1)大鼠肺组织羟脯氨酸含量
　　第1、7、14天时大鼠矽肺组和对照组羟脯氨酸含量没有明显差别,第28天时矽肺组羟脯氨酸含量显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　(2)大鼠肺组织形态学改变
　　对照组大鼠肺组织正常无损,实验组大鼠在染尘1至7天表现为急性炎症改变,第28天成纤维细胞增生加剧,纤维组织成条索状,可见纤维小结。
　　(3)实时荧光定量PCR实验结果
　　荧光实时定量PCR结果显示矽肺组和对照组大鼠的肺组织在所有时间点均有Rln1和Rxfp1mRNA表达。矽肺组在第7天时Rln1显著高于至对照组(P<0.05),第28天时降低至对照组水平以下(P<0.05)。矽肺组在第1天时Rxfp1 mRNA表达高于对照(P<0.05),第7天时减弱至对照组水平,第28天降低至对照组以下(P<0.05)。
　　(4)免疫组织化学实验结果
　　矽肺组肺松弛素蛋白表达呈现先上升后下降的趋势,主要定位于Ⅰ型肺泡细胞和巨噬细胞;与对照组相比,染石英尘后第7天松弛素蛋白水平明显增高(P<0.05),第28天时则明显减少(P<0.05)。染石英尘后第1天 RXFP1蛋白水平明显增高(P<0.05),第28天时明显减少(P<0.05)。主要定位于巨噬细胞和成纤维细胞。
　　结论:羟脯氨酸含量变化和HE染色结果显示大鼠矽肺模型构建成功。在该模型中,矽肺形成时大鼠肺组织中内源性松弛素及其受体RXFP1的表达随矽肺进程变化明显,主要定位于肺泡细胞、巨噬细胞和成纤维细胞,提示矽肺形成过程中松弛素很可能通过上述细胞起作用。
　　第二部分松弛素对DQ12染毒THP-1纤维化细胞因子mRNA表达的影响
　　目的:在第一部分研究的基础上,进一步探讨矽肺发生过程中松弛素可能的来源,及其在炎症反应期的作用。
　　方法:本部分以佛波酯(PMA)刺激分化THP-1,其后将细胞分四组处理:MEM对照组、DQ12(200μg/ml)单独染毒组、松弛素(10ng/ml)单独染毒组、DQ12(200μg/ml)和松弛素(10ng/ml)联合染毒组,分别在1、3、6、12、24h以实时荧光定量PCR法检测RLN2、RXFP1、TGFB1等基因mRNA变化。
　　结果:
　　(1)PMA诱导分化结果
　　以10ng/ml刺激THP-148h,90％以上的THP-1细胞开始贴壁,细胞形态为梭形,具有巨噬细胞的形态特征。
　　(2)RLN2 mRNA实验结果
　　与对照组相比,DQ12单独染毒3h及24h时THP-1细胞RLN2 mRNA表达显著增高(P<0.05),外源性松弛素单独染毒24h时THP-1细胞RLN2 mRNA的表达显著降低(P<0.05)。与DQ12单独染毒组相比,DQ12和松弛素联合染毒3h及24h时RLN2 mRNA表达显著下降(P<0.05)。
　　(3)RXFP1 mRNA实验结果
　　与对照组相比,DQ12单独染毒24h后THP-1细胞RXFP1 mRNA表达显著增高(P<0.05),外源性松弛素单独染毒1h时THP-1细胞RXFP1 mRNA表达显著增高,染毒24h时则显著降低(P<0.05)。
　　(4)TGFB1 mRNA实验结果
　　与对照组相比,DQ12单独染毒12h后THP-1细胞TGFB1基因mRNA表达显著增高(P<0.05)。与DQ12单独染毒组相比,DQ12和松弛素联合染毒3h时THP-1细胞TGFB1基因mRNA表达显著降低(P<0.05)。
　　结论:DQ12可诱导THP-1中松弛素及其受体RXFP1的表达,而外源性松弛素可明显弱化这种效应,提示矽肺发生过程中巨噬细胞是内源性松弛素的来源之一。
　　第三部分松弛素对MRC-5成纤维细胞功能的影响
　　目的:以THP-1和MRC-5细胞构建矽肺体外细胞模型,以深入研究外源性松弛素的抗纤维化机制。
　　方法:即先用佛波酯诱导分化THP-1细胞,再以DQ12染毒已分化的THP-1,12h后提取THP-1培养上清(THP-1 CS)。随后将MRC-5细胞分四组处理:MEM对照组、THP-1 CS单独染毒组、松弛素(1、10、100ng/ml)单独染毒组、THP-1 CS和松弛素(1、10、100ng/ml)联合染毒组,染毒48h后检测检测MRC-5细胞的增殖,以实时荧光定量PCR法、明胶酶谱法和酶联免疫法检测MRC-5细胞MMP-2的表达和活性、胶原的合成和分泌。
　　结果:
　　(1)细胞增殖结果
　　与对照组相比,THP-1 CS可明显增强MRC-5的增殖(P<0.05);与THP-1 CS单独染毒组相比,THP-1 CS和松弛素联合染毒能显著降低MRC-5的增殖(P<0.05)。松弛素单独处理对细胞增殖的作用不明显。
　　(2)实时荧光定量PCR实验结果
　　与对照组相比,THP-1 CS可明显增强MRC-5细胞COL1A1的表达(P<0.05)。与THP-1 CS单独染毒组相比,THP-1 CS和松弛素联合染毒组COL1A1的表达显著降低(P<0.05)。此外,松弛素单独染毒组MRC-5细胞MMP2的表达显著高于对照组(P<0.05)。与THP-1 CS单独组相比,THP-1 CS和100ng/ml松弛素联合染毒组MMP2的表达显著降低(P<0.01)。
　　(3)明胶酶谱结果
　　与对照组相比,THP-1 CS可明显增强MMP-2的活性(P<0.05)。与THP-1 CS单独染毒组相比,THP-1 CS和松弛素联合染毒MMP-2的活性显著增强(P<0.01)。
　　(4)酶联吸附实验结果
　　与对照组相比,THP-1 CS可明显增加MRC-5上清中I型胶原含量(P<0.05)。与THP-1 CS单独染毒组相比,THP-1 CS和松弛素联合染毒组I型胶原含量显著减少(P<0.01)。
　　结论:本部分研究结果提示松弛素可能通过如下方式影响矽尘诱导的、巨噬细胞介导的肺纤维化:1)抑制细胞增殖,2)抑制胶原合成,3)诱导MMP-2活性。这些结果表明松弛素具有治疗矽肺的潜力。

著录项

作者
李小峰;
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作者单位

华中科技大学;

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授予单位华中科技大学;
学科劳动卫生与环境卫生
授予学位博士
导师姓名鲁文清;
年度 2012
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正文语种中文
中图分类生产性粉尘及尘肺;
关键词
矽肺; 松弛素; 肺纤维化; 拮抗机制;

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