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【6h】

热休克蛋白-70在脑缺血预处理诱导脑缺血耐受中的作用及其机制的实验研究

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摘要

第一部分
　　 目的：研究局部脑缺血预处理(ischemic preconditioning[PC])、HSP70的表达和对随后发生的局灶脑缺血的保护作用。
　　 方法：应用改进的Longa’s法，建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)的局部脑缺血预处理诱导脑缺血耐受 (ischemic tolerance[IT])模型。MCAO20min作为PC，分别在再灌注12h、1d、3d、5d、7d、14d后造成永久性MCAO(PMCAO)并与未行PC的假手术组对照。检测以下指标：TTC染色测量梗死体积；神经功能缺失评分；HE染色观察组织结构变化；同时应用原位杂交、免疫组织化学染色和RT-PCR、Western blotting观察PC后HSP70表达的变化。每小组动物5只。
　　 结果：PC组1d、3d、5d、7d与未行PC组比较，PMCAO后24h脑梗死体积明显减小(P<0.01)，神经功能缺损明显减轻(P<0.05)；PC后不同时间点与假手术组比较缺血区HSP70mRNA(12h、1d、3d、5d)(P<0.01)和蛋白(1d、3d、5d、7d)的表达明显增加(P<0.05)。
　　 结论：PC可以充分诱导其后1～7d的脑缺血耐受，同时PC诱导HSP70表达，可能与缺血耐受的产生有关。
　　 第二部分
　　 目的：探讨HSP70蛋白合成在脑缺血预处理(PC)诱导脑缺血耐受(IT)中的作用和对细胞凋亡的影响。
　　 方法：应用改进的Longa’s法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)的局部脑缺血预处理诱导脑缺血耐受(IT)模型。MCAO20min作为PC，PC后24h给予永久性MCAO(PMCAO),并与未进行PC假手术组比较。免疫印记(Western blotting)法测量PC24h后HSP70的变化,TUNEL法、流式细胞仪(flow cytometry，FCM)检测大鼠前脑皮质细胞的凋亡；同时观察在PC前或PC后PMCAO前给予蛋白合成抑制剂放线菌酮对PC后24h HSP70、PMCAO后24h脑梗死体积、神经功能评分和细胞凋亡的影响。每组动物5只。
　　 结果：PC组PMCAO后24h脑梗死体积明显减小(P<0.01),神经功能评分降低(P<0.05)、细胞凋亡数和凋亡率降低(P<0.05)；PC前给予放线菌酮消除了以上影响，但在PC后较长时间而在PMCAO之前给予则没有以上影响；HSP70在PC后1d明显表达，而在PC前30min给予放线菌酮抑制了HSP70的表达(P<0.05)。
　　 结论：HSP70的合成在PC诱导脑缺血耐受中发挥重要作用，可能是通过抑制神经细胞凋亡实现的。
　　 第三部分
　　 目的：探讨HSP70在缺血预处理诱导脑缺血耐受中抑制细胞凋亡的机制。
　　 方法：应用改进的Longa’s法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)局部脑缺血预处理诱导脑缺血耐受(IT)模型。MCAO20min作为PC，PC后24h给予永久性MCAO(PMCAO)，并与未进行PC假手术组比较。免疫组织化学和免疫印记(Western blotting)法测量PMCAO24h后c-fos、bcl-2和caspase-3的变化,同时观察在PC前给予蛋白合成抑制剂放线菌酮对c-fos、bcl-2和caspase-3的影响。
　　 结果：PC-PMCAO组PMCAO后24h c-fos、bcl-2表达增加，caspase-3表达减少，与假手术(SS-PMCAO)组比较均有显著行差异(P<0.05)。PC前给予放线菌酮消除了以上影响。
　　 结论：HSP70在PC诱导脑缺血耐受中抗神经细胞凋亡的作用可能是通过促进再缺血后c-fos bcl-2的表达、抑制caspase-3的表达实现的。
　　 第四部分
　　 目的：研究氧-糖剥夺预处理和HSP70表达在诱导体外培养神经细胞缺血耐受中的作用.
　　 方法：原代培养的大鼠皮层神经细胞进行非致死性氧-糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation[OGD])20min作为预处理(ischemic preconditioning[PC])，分别在PC后12h、24h、48h、72h进行第二次致死性OGD50min,建立体外缺血耐受模型。致死行OGD后24h测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase[LDH])检测神经元损伤的程度、台盼兰染色检测神细胞死亡率；RT-PCR、免疫组织化学、Western blotting测定PC后HSP70的表达；同时测定在PC前30min或PC后较长时间而在致死性OGD前应用放线菌酮对神经细胞损伤和在PC前30min应用放线菌酮对HSP70蛋白的影响。
　　 结果：与致死性OGD组比较PC-OGD组OGD后24h、48h LDH水平明显减低(P<0.05)、神经细胞死亡数减少(P<0.05)，同时PC后12h、24h、48h HSP70mRNA的表达增加(P<0.05)，24h、48h HSP70蛋白的表达增加(P<0.01)，而PC后12h、72h组则无变化。在PC前应用放线菌酮消除了PC-OGD组OGD后24h上述指标的变化，而在PC后较长时间应用放线菌酮对此则无影响。同时PC前应用放线菌酮抑制了HSP70蛋白的表达(P<0.05)。
　　 结论：20min OGD预处理成功的诱导了体外皮层神经细胞的缺血耐受，这种作用可能与HSP70的高表达有关。
　　 第五部分
　　 目的：探讨氧-糖剥夺预处理对体外培养神经细胞凋亡的保护作用及机制方法原代培养的大鼠皮层神经细胞进行非致死行的氧-糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation[OGD])20min作为预处理(ischemic preconditioning[PC])，在PC后24h进行第二次OGD50min,建立体外缺血耐受模型。流式细胞仪、TUNEL法，吖啶橙荧光染色测定致死行OGD后24h细胞凋亡率和凋亡细胞数。免疫组织化学和免疫印迹测定致死行OGD后24h bcl-2、caspase-3的表达。
　　 结果：与对照组相比PC-OGD组致死性OGD后24h神经细胞凋亡百分率和凋亡阳性细胞均减少(P<0.05)，同时发现其致死性OGD24h后bcl-2表达增加(P<0.05)而caspase-3表达减少(P<0.05)。
　　 结论：PC对体外培养大鼠神经细胞凋亡有保护作用，这种作用可能是通过促进随后发生的致死性OGD后bcl-2表达、抑制caspase-3表达实现的。

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