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鲫感染鲤疱疹病毒Ⅱ的组织病理学研究

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摘要

第一章 文献综述

1.1 国内鲫养殖现状

1.2 鲤疱疹病毒Ⅱ的研究进展

1.2.1 CyHV-2的生物学特征

1.2.2 CyHV-2基因组

1.2.3 CyHV-2的流行特点

1.2.4 CyHV-2的诊断方法

1.3 研究目的与意义

第二章 鲤疱疹病毒Ⅱ定量检测方法的建立

2.1 材料与方法

2.1.1 主要试剂和溶液

2.1.2 实验仪器

2.1.3 CyHV-2毒株的来源

2.1.4 组织DNA提取

2.1.5 引物设计

2.1.6 CyHV-2的TK基因的扩增

2.1.7 标准质粒的构建

2.1.8 荧光定量方法的构建

2.2 结果与分析

2.2.1 TK基因的扩增

2.2.2 T-easy-TK重组质粒的鉴定

2.2.3 定量引物退火温度

2.2.4 基于TK基因的荧光定量标准曲线构建

2.3 讨论

第三章 鲫的CyHV-2载量研究

3.1 材料与方法

3.1.1 实验动物及其人工感染CyHV-2

3.1.2 自然感染CyHV-2的金鱼和鲫的来源

3.1.3 DNA提取及浓度测定

3.1.4 CyHV-2定性检测

3.1.5 CyHV-2的定量检测

3.2 结果与分析

3.2.1 人工急性感染CyHV-2的临床症状和定性检测

3.2.2 人工慢性感染CyHV-2的临床症状和定性检测

3.2.3 自然感染CyHV-2定性检测

3.2.4 人工急性感染CyHV-2的载量分析

3.2.5 人工慢性感染CyHV-2的鲫的载量分析

3.2.6 自然感染CyHV-2的载量分析

3.3 讨论

第四章 CyHV-2介导的组织病理学研究

4.1 实验材料与方法

4.1.1 主要试剂和溶液配制

4.1.2 实验仪器

4.1.3 实验材料

4.1.4 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 人工急性感染CyHV-2后的组织病理学变化

4.2.2 人工慢性感染CyHV-2后的组织病理学变化

4.2.3 自然感染CyHV-2后的组织病理学变化

4.3 讨论

第五章 CyHV-2细胞嗜性的初步探究

5.1 实验材料与方法

5.1.1 主要试剂和溶液配制

5.1.2 实验仪器

5.1.3 实验材料

5.1.4 实验方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

参考文献

硕士期间发表的文章

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摘要

鲫(Carassius auratus)是我国最重要的淡水经济鱼类,其变异品种繁多,包括具有观赏价值的金鱼和其他变种鲫。近年来,国内鲫养殖产业不断遭到疾病的威胁,其中由鲤疱疹病毒Ⅱ(CyHV-2)引起的疾病最具代表性。CyHV-2是疱疹病毒性造血器官坏死症的病原,仅感染金鱼(Carassius auratus)、鲫(Carassius auratus)及其变种,当水温在15~25℃时,可造成近100%的死亡率。目前,CyHV-2的已有研究成果主要有病毒的形态及分类地位、流行特点、分子诊断技术和CyHV-2部分分离株全基因序列,但CyHV-2介导的组织损伤不系统,其致病机理尚未明晰。为了全面了解CyHV-2对金鱼、鲫的组织损伤,本研究通过CyHV-2人工感染并结合自然感染CyHV-2的材料,系统研究CyHV-2在鱼体各组织的增殖过程及其介导的组织病理损伤,主要研究结果如下:
  (1)本研究选取CyHV-2分离株SY-C1编码的胸腺激酶(TK)基因作为病毒全基因组的等价物,建立了CyHV-2的荧光定量PCR法,其准确定量的范围为102~1011。
  (2)以异育银鲫为对象,构建CyHV-2的急性和慢性感染模型,结合自然感染材料,分析CyHV-2的增殖过程。急性感染模式下,病毒感染3天后,感染鱼开始死亡,脾肾组织的病毒含量迅速上升到108拷贝数/μg DNA以上,并持续上升直至死亡率降低。慢性感染模式下,脾肾组织的病毒拷贝数多在106拷贝数/ug DNA以下,实验周期内无死亡率发生。自然感染与人工慢性感染的病毒载量接近,表明两者的感染程度相似。比较人工感染和自然感染的鱼体各组织的病毒载量的变化规律,说明鳃和中肾均为病毒的易感组织,推测病毒主要通过血道在鱼体内散播。
  (3)系统分析了不同感染模式下鱼体鳃、脾、中肾、肝、肠和脑组织的病理变化过程。急性感染条件下,鳃、脾、中肾和脑组织的病理损伤严重,主要以坏死病变为主,其中脾脏的广泛性点状坏死灶为最典型的特征。人工慢性感染和自然感染条件下,鱼体初级鳃小片增生,次级鳃小片卷曲和上皮脱落;脾脏内实质组织的凝固性坏死,网状造血细胞由弱碱性转变为嗜酸性,致使网状结构呈现强烈的嗜酸性;中肾组织内形成新生核的肾小管上皮细胞比例上升,炎症、组织内出血、肉芽组织、实质组织凝固性坏死和肾小管上皮细胞颗粒样变性;肝细胞色素代谢障碍,脂褐素累积;肠道小肠绒毛上的杯状细胞数量和分泌活性变化;局部神经细胞坏死、胶质细胞和浦肯野氏细胞坏死以及神经纤维断裂。组织病理分析结合病毒增殖过程,慢性感染模式是自然感的重复,且慢性感染和自然感染鱼体脾脏的组织病理变化部位与急性感染模式下脾脏内大量点状坏死病灶的部位相同。
  此外,本文还尝试以CyHV-2的易感组织中肾为研究对象,以原位杂交探究CyHV-2的细胞嗜性。初步研究结果显示患病鱼的中肾组织内出现大量阳性杂交信号,且杂交信号主要分布在肾小管上皮细胞核上,说明肾小管上皮细胞是CyHV-2的敏感细胞之一。

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