通城猪和大白猪干扰素诱导基因GBP1、GBP2的不同等位基因鉴定及其抗PRRSV的作用研究

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猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征，是全球性的重要的猪传染性疾病。该病由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起，该病毒在体内的靶细胞主要为猪的肺泡巨噬细胞该病以妊娠母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸道症状为主要特征，并伴随着高热、器官损伤以及精神抑郁。对蓝耳病的防控主要途径是通过病原控制、环境控制及免疫接种为主，尽管这些措施对蓝耳病的控制可以起到一定作用，但是都不能从根本上控制和消除蓝耳病的影响以及流行。因此，开展抗病育种可能是从根本上解决蓝耳病危害的可行办法。
　　GBP是一类分子量为65~67KD的鸟苷酸结合蛋白，可以被干扰素诱导且具有GBPase活性，属于发动蛋白家族成员（dynamin family of GTPases），研究表明：鼠的GBP2可以抑制水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV）和脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）的复制(Carter et al.2005）。此外，在GBP1敲除小鼠中，活体感染Mb BCG（Mycobacterium bovis BCG）后，组织有明显的病理损伤。目前对GBP的蛋白结构已有报道，但是其具体功能尚不清楚。本实验通过前期活体人工感染 HP-PRRSV实验芯片数据筛选出感染前后差异表达基因GBP1/GBP2，并且发现在同样条件下感染的大白猪的组织病理变化明显较通城猪严重。为了研究不同品种（大白猪与通城猪）的GBP1/GBP2的品种间SNP在抗PRRSV中的机制及功能，本研究通过对通城猪和大白猪的 CDS全长进行扫描，并建立在Marc-145细胞稳定表达的PRK表达系统，用Western Blot验证重组质粒的表达后感染PRRSV后利用Q-PCR检测病毒增殖效率，所取得的结果如下：
　　1.对大白猪和通城猪进行CDS扩增并测序，扫描出GBP1/GBP2通城猪和大白猪品种间的SNP。GBP1有4个，其中2个改变氨基酸其中改变氨基酸结构有两个,分别为： c.8.A>C（K赖氨酸-G甘氨酸）、c.65.C>T（A丙氨酸-V缬氨酸），在蛋白的结构中分别位于β-1和α0位。GBP2中存在5个的SNP位点，其中有两个改变氨基酸结构：c.538.T>C突变（Y酪氨酸-H组氨酸），c.1378.A>C（T苏氨酸-K赖氨酸），在蛋白结构上位于α9和α10位。
　　2.利用Clustalx软件进行分析，对比了人、猪和小鼠的GBP1蛋白，发现在不同物种中它们的保守性高达79％（人和猪）、82%（鼠和猪），GBP蛋白中各种的功能结构域高度保守，例如比较典型的区域：GLYRTGKS区域，DTEG区域，TLRT区域，CAAX结构。
　　3.将两个品种GBP1/GBP2的单倍型构建到真核表达载体pRK-Flag上，在体外转染Marc-145细胞并感染PRRSV（WUH2），并用GBP特异引物半定量检测转染成功，利用Western Blot检测pRK-7-Flag-Insert-GBP1/GBP2表达系统的效率，结果显示，pRK表达系统有稳定且特异性的蛋白表达。
　　4.应用定量RT-PCR方法检测了表达两种单倍型载体的Marc-145中病毒增殖量的差异，发现GBP1的超表达可以抑制PRRSV的增殖（p<0.01)，这与前期人工感染的芯片数据一致，但是通城和大白两个单倍型之间对PRRSV的抑制作用不显著（p>0.01)。

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作者
杜小川;
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作者单位

华中农业大学;

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授予单位华中农业大学;
学科动物遗传育种与繁殖
授予学位硕士
导师姓名刘榜;
年度 2013
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类猪;
关键词
猪; 蓝耳病; 抗病育种; 干扰素诱导; 等位基因鉴定;

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