南方红豆杉愈伤组织培养及其紫杉醇含量调控的优化研究

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南方红豆杉(Taxus chinensis vat.mairei)，为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)在中国的1个变种，其枝、皮、叶、根和果肉中均含有抗癌药物紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)。为了利用南方红豆杉愈伤组织培养生产紫杉醇，本研究采用HPLC、正交实验、愈伤组织直径测量、称重等方法，对南方红豆杉嫩茎、较成熟幼茎皮、形成层组织、嫩叶、顶端分生组织5种外植体的愈伤组织诱导培养、培养基优化、愈伤组织生长和紫杉醇生物合成量调控的优化等进行了较为系统的研究。结果显示：愈伤组织诱导，培养基以MS+1.2mg/L2,4-D+4mg/LNAA+2.8mg/L6-BA为佳，外植体以嫩茎和顶端分生组织最佳，其次为幼叶。愈伤组织生长增殖的优化培养基为B5+0.4 mg/L 2,4-D+3.2 mg/L NAA+0.1 mg/L KT和B5+0.4 mg/L 2,4-D+3.2 mg/LNAA+0.8 mg/L。KT。有利于愈伤组织生产紫杉醇的培养基为：B<,5>+0.8 mg/L2，4-D+2.Omg/L NAA+0.2 mg/L KT+0.1 mg/L CH。即有利于愈伤组织生长又有利于生产紫杉醇的培养基为B<,5>+1.2 mg/L 2,4-D+3.2 mg/LNAA+0.1 mg/L KT+0.1 mg/L CH(生长率为3.24倍/周期，1个周期约为45 d～50 d，紫杉醇含量为0.0187％)。在5种外植体中，嫩茎和叶愈伤组织合成紫杉醇的能力较其它愈伤组织强。采用杜仲绿原酸调控，以加快愈伤组织生长为目的时应选择生长初期愈伤组织。以增加愈伤组织中紫杉醇产量为目的时则选择生长旺盛期或生长停滞期愈伤组织，前者在培养基中加入1 mg/L左右95％的杜仲绿原酸可使愈伤组织中紫杉醇的含量达到0.0658％，是该组最低样的100倍；后者紫杉醇的含量呈随绿原酸浓度的增加而不断增加的趋势，当绿原酸加到10 mg/L时，愈伤组织中紫杉醇的含量达0.025％，是对照0.0058％的4.3倍。0.1 mg/L绿原酸+0.1mg/L水杨酸+1.7mg/L硝酸银可诱导愈伤组织中紫杉醇含量达0.0735％，比对照(未能检出紫杉醇的含量)提高近100倍。采收后的愈伤组织用南方红豆杉菌根真菌F进行发酵转化后，愈伤组织中紫杉醇的含量较对照提高15倍之多。这一过程对加入的菌液量、发酵转化时间均较敏感。过多、过长都会导致愈伤组织中紫杉醇含量的降低，以每20 g愈伤组织中加入10 mL菌液、发酵转化0.5 d为佳。由南方红豆杉外植体来源的差异和培养基中植物生长调节剂的差异所引起的愈伤组织生长量间的差异会因反复继代培养被消除。有利南方红豆杉愈伤组织生长的植物生长调节剂配方没有唯一性。但不同调节剂浓度和组合作用下的同源愈伤组织中、相同调节剂作用下不同源愈伤组织中紫杉醇含量均存在着极显著差异，适当水平(2mg/L)的2,4-D单用，或与适当水平的KT、6-BA、KT+GA配合使用，对南方红豆杉愈伤组织紫杉醇的合成较有利，NAA则不太有利。南方红豆杉愈伤组织的生长周期约为45d，延滞期约为5d，第6天到第35天为快速生长期，此后进入稳定期，约第50天后愈伤组织开始衰老、褐变。 2,4-D和NAA对愈伤组织的生长和紫杉醇的生物合成均存在交互作用，0.4 mg/L2,4-D+3.2 mg/L NAA对愈伤组织生长最为有利，0.8 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L NAA组合明显有利于愈伤组织紫杉醇的生物合成。 CH不利于南方红豆杉愈伤组织的生长。南方红豆杉愈伤组织中具有较高含量的紫杉烷类化合物。采用两种观测研究愈伤组织生长的方法所获得的结果比较一致，说明两种方法均可行。但愈伤组织直径观测法因避免了将愈伤组织取出观测的一系列繁琐的无菌操作过程而更简便、易行。对生长初期愈伤组织，其生长速率随绿原酸浓度的增加而加快，但紫杉醇含量反而下降。当培养基中绿原酸浓度超过1.0 mg/L后，愈伤组织生长量就不再随加入绿原酸量的增加而增加。绿原酸使南方红豆杉愈伤组织的颜色普遍比对照浅，有减轻愈伤组织褐变的作用。利用真菌发酵转化，可使南方红豆杉愈伤组织中紫杉醇类似物发生转化，使原有5～6种含量较高的类似物均转化成了2～3种，且这种效应对时间较敏感，时间过长有可逆现象。

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作者
杜亚填;
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作者单位

湖南农业大学;

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授予单位湖南农业大学;
学科植物学
授予学位硕士
导师姓名周朴华;
年度 2006
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类红豆杉、紫杉;
关键词
红豆杉; 愈伤组织; 紫杉醇; 组织培养; 生长调节剂;

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