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miR-125b-STAT3反馈调节环路参与骨肉瘤发生发展机制及血清microRNA作为骨肉瘤潜在生物标志物的研究

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摘要

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前言

第一部分 miR-125b-STAT3调节环路在骨肉瘤中发生、发展中的作用机制研究

第一节 miR-125b-STAT3环路在骨肉瘤组织和细胞中的表达

前言

材料和方法

结果

第二节 miR-125b靶向调控下游基因：STAT3

前言

材料和方法

结果

第三节 STAT3对miR-125b的转录激活作用

前言

材料和方法

结果

第四节 miR-125b启动子区域甲基化状态

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 血清microRNA作为骨肉瘤生物标记物的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 骨肉瘤的表观遗传学改变

攻读学位期间主要的研究成果

致谢

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摘要

骨肉瘤(osteosarcoma)是青少年最常见的原发恶性骨肿瘤，也是骨科学界治疗的难点之一。据我国统计资料显示，骨肉瘤发病率在原发性恶性骨肿瘤中占居首位。该瘤恶性程度甚高，预后极差，可于数月内出现肺部转移，截肢后3～5年存活率仅为60％左右。
　　虽然近年来骨肉瘤在病因、发生发展、诊断和治疗等方面有了一些进展，但进展十分缓慢，具体发病机制仍然不清楚。其次缺少骨肉瘤诊断和治疗的有效靶标，进一步寻找生物靶标，将具有重要的理论和临床应用价值。同时如能获得骨肉瘤血清诊断标志物，将对骨肉瘤的诊断和治疗带来深远的影响。
　　microRNA是一种不编码蛋白质的，约21-25nt大小的单链小分子RNA。通过特异性的结合靶基因来调控其表达。从1993年，第一个microRNA:lin-4被发现后，在过去的几十年，大量的microRNA被发现并认为在细胞的发生、分化、增殖和凋亡起着重要的作用。近期研究表明，microRNA的表达变化与肿瘤的发生、发展、诊断、预后相关。在不同的肿瘤类型中，microRNA呈现两种不一样的角色:抑癌基因和癌基因。主要的作用机制包括:microRNA位点的缺失、扩增、突变，表观遗传水平改变，转录调控因子的异常表达等。值得关注的是，microRNA具有一个重要特性，即在血浆和血清中非常稳定，不会被RNA酶降解。这使得其实际值与病人身上所得的测试值吻合的很好，如果能在外周血标本中找到特异性表达模式的microRNA生物标记物，对于早期诊断和治疗肿瘤具有重大的意义。
　　STAT3蛋白是一种重要的转录因子，在生理状态下，STAT3激活快速而短暂，对于正常细胞的生理功能起着关键性作用。STAT3是EGFR、IL26/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道汇聚的焦点，在多种肿瘤细胞中均发现有持续性过度激活。STAT3过度激活后诱导细胞增殖、分化、凋亡密切相关的关键基因异常高表达，通过各种途径促进细胞增殖、恶性转化、阻碍细胞凋亡。STAT3激活可上调多种抗调亡基因(c-myc)、细胞周期调节基因(cyclin D1/D2)等，通过诱导转移相关基因MMP、VEGF等表达来促进肿瘤的转移和血管生成。而且STAT3与肿瘤的临床生物学行为如肿瘤浸润深度、淋巴结转移及肿瘤细胞的耐药性等相关。
　　本课题利用microRNA表达芯片技术比较了六例骨肉瘤组织标本与癌旁组织分化成熟区域，发现miR-125b在骨肉瘤病人肿瘤细胞中表达显著下调。我们推测miR-125b在骨肉瘤的发生发展中具有重要的作用，即潜在抑癌基因的功能。本课题组的前期实验已经证明miR-125b能明显抑制骨肉瘤的增殖，迁移，但作用机制不明。通过生物信息学分析，我们发现STAT3的3'UTR有一保守的miR-125b结合位点，提示STAT3可能为miR-125b的候选下游靶基因。同时我们发现miR-125b的核心启动区具有CAAT元件，两个STAT3结合位点，一个STAT6结合位点，提示STAT3可以特异性结合于miR-125b核心启动子区域。综上所述，STAT3可以转录激活miR-125b，同时STAT3自身受到miR-125b转录后抑制调控，我们推论STAT3-miR-125b之间可能存在反馈调节环路。生理状态下，细胞不需要过多的STAT3，STAT3受miR-125b转录后抑制;过多的STAT3可通过转录激活产生更多的miR-125b，抑制STAT3而达到、维持miR-125b-STAT3间稳态平衡。骨肉瘤细胞中，STAT3表达高而miR-125b表达下降，为什么持续激活的STAT3不能反馈转录激活miR-125b?进一步分析表明miR-125b启动子具有CpG岛，该反馈调节环路可能由于肿瘤细胞中启动子表观遗传调节而打断。本课题通过两部分来研究STAT3-miR-125b反馈调节环路在骨肉瘤中发生、发展中的作用机制以及骨肉瘤患者中血清microRNAs生物标记物的筛选。
　　第一部分:miR-125b-STAT3调节环路在骨肉瘤中发生、发展中的作用机制研究:
　　(1) miR-125b-STAT3环路在骨肉瘤组织和细胞中的表达;
　　(2) miR-125b靶向调控下游基因:STAT3;
　　(3)STAT3对miR-125b的转录激活作用;
　　(4)骨肉瘤细胞miR-125b启动子区域甲基化状态。
　　第二部分:血清microRNA作为骨肉瘤生物标记物的研究。通过这些研究，揭示miR-125b-STAT3反馈调节环路在骨肉瘤发生、发展中的作用机制，发现潜在的治疗靶标和可供诊断参考的生物标志物，有望为骨肉瘤的临床诊断和治疗提供新的策略和方法。
　　第一部分 miR-125b-STAT3调节环路在骨肉瘤中发生、发展中的作用机制研究
　　第一节 miR-125b-STAT3环路在骨肉瘤组织和细胞中的表达
　　目的:研究骨肉瘤组织和细胞系中miR-125b和STAT3的表达水平。
　　方法:通过实时定量RT-PCR法，在骨肉瘤和癌旁组织二组样品中以及骨肉瘤的三种细胞系，检测miR-125b的表达水平。其次，通过免疫印迹法(Western blot)检测骨肉瘤组织和细胞系中STAT3的蛋白水平。
　　结果:与癌旁组织相比，骨肉瘤组织中miR-125b水平显著降低。与HEK-293细胞系相比，骨肉瘤的三种细胞系(MG-63，Saos-2，U2-OS)中miR-125b水平显著降低。与癌旁组织相比，骨肉瘤中STAT3蛋白表达水平显著升高;与HEK-293细胞系相比，骨肉瘤的三种细胞系(MG-63，Saos-2，U2-OS)中STAT3蛋白表达水平均显著提高。
　　结论:骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞中，miR-125b表达水平显著降低，而STAT3的表达水平显著升高。此结果提示二者可能参与骨肉瘤的发生、发展过程。
　　第二节 miR-125b靶向调控下游基因STAT3
　　目的:验证STAT3为miR-125b的下游靶基因。
　　方法:
　　1.我们运用Targetscans/PICTAR等靶基因预测软件预测miR-125b的下游靶基因可能为STAT3。
　　2.构建荧光素酶表达载体将STAT3的3'UTR区包含可能与miR-125b结合的一段序列克隆至pMIR-REPORTER Luciferase vector载体内，从而构建STAT3野生型（STAT3 WT-luc）荧光素酶报告基因质粒。而后通过点突变的方法使STAT3的3'UTR区包含可能与miR-125b结合的一段碱基序列发生突变，构建STAT3突变型（STAT3MUT-luc）荧光素酶报告基因质粒。采取脂质体转染的方法将STAT3WT-luc和STAT3MUT-luc与miR-125b模拟物(miR-125b mimics)和阴性对照(Negative control)同时转染到MG-63细胞内。转染48小时后收取细胞，本实验采取双荧光素酶报告基因系统，以海肾荧光素酶(Renilla)作为内参，检测萤火虫荧光素酶(Firefly)的活性。最终以二者的比值作为相对表达量数值(Firefly/Renilla)。
　　3.采用脂质体转染的方法将不同浓度miR-125b模拟物(miR-125b mimics)转染到Saos-2细胞内，采用蛋白质印迹(Westernblot)检测STAT3蛋白表达水平;CKK8法检测细胞增殖活性。
　　4.采用脂质体转染的方法将miR-125b模拟物(miR-125bmimics)、化学合成并化学修饰的miR-125b反义核酸(anti—miR-125b)或者阴性对照(Negative control)转染至MG-63和Saos-2细胞内。收集细胞后提取总蛋白，采用蛋白质印迹法(Western blot)检测STAT3蛋白表达水平。
　　结果:
　　1.STAT3为miR-125b的靶基因，miR-125b通过结合3'UTR区抑制靶基因STAT3的表达。
　　2.miR-125b浓度依赖性的调节细胞增殖，过表达miR-125b能抑制Saos-2细胞增殖，抑制STAT3蛋白表达量。
　　3.转染miR-125b模拟物的骨肉瘤细胞MG-63和Saos-2中STAT3蛋白表达量降低。
　　4.转染miR-125b反义核酸的骨肉瘤细胞MG-63和Saos-2中STAT3蛋白表达量升高。
　　结论:STAT3是miR-125b的靶基因，miR-125b通过结合STAT3的3'UTR区抑制靶基因STAT3的表达。
　　第三节 STAT3对miR-125b的转录激活作用
　　目的:探讨STAT3作为重要的转录因子能否转录激活miR-125b。
　　方法:
　　1.我们首先采取CONSITE和PromoterInspector软件分析预测成熟miR-125b在人基因组上的两个基因位点上游的10kb序列，分别是11号染色体上的miR-125b-1，21号染色体上的miR-125b-2。找到潜在的启动子区域。
　　2.构建荧光素酶表达载体将miR-125b-1前体5'端不同长度片段（-1600 to-900bp，-1400 to-900bp，-1175 to-900bp）序列克隆至PGL3载体。再转染到骨肉瘤细胞MG-63和Saos-2中，转染48小时后收取细胞，本实验采取双荧光素酶报告基因系统，以海肾荧光素酶(Renilla)作为内参，检测萤火虫荧光素酶(Firefly)的活性。最终以二者的比值作为相对表达量数值(Firefly/Renilla)。
　　3.我们选用MatInspector软件对启动子区域的顺式作用元件进行分析，找出可能存在的转录因子结合位点。
　　4.采取点突变的办法使-1175 to-900bp序列中潜在的STAT3结合序列、STAT6结合序列和CAAT序列发生碱基突变，构成PGL3-mSTAT3,PGL3-mSTAT6和PGL3-mCAAT突变荧光素酶报告基因质粒。转染到骨肉瘤细胞MG-63和Saos-2中，转染48小时后收取细胞，本实验采取双荧光素酶报告基因系统，以海肾荧光素酶(Renilla)作为内参，检测萤火虫荧光素酶(Firefly)的活性。最终以二者的比值作为相对表达量数值(Firefly/Renilla)。
　　5.我们通过凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)来进一步鉴定STAT3蛋白和miR-125b前体上与STAT3蛋白相结合序列之间的相互作用，首先人工合成STAT3-wt、STAT3-consensus、 STAT3-mut、STAT6-wt寡核苷酸序列探针，其中STAT3-consensus为STAT3所识别的共有序列作为实验中的阳性对照，再将其中的STAT3-wt和STAT3-consensus用32P同位素标记上，根据不同的探针组合、STAT3抗体与MG-63细胞核蛋白提取物共孵育，最后根据DNA-蛋白复合物的位置、特点和强度来判断特异性结合。
　　结果:
　　1.通过CONSITE和PromoterInspector软件我们发现miR-125b-1有一个RNA聚合酶Ⅱ核心启动子位于miR-125b前体序列上游-1600to-900bp。
　　2.分析不同片段的荧光素酶活性，我们确定核心启动子序列位于-1175 to-900bp区域。
　　3.通过MatInspector软件分析，我们预测在其核心启动子区域具有CAAT元件，两个STAT3结合位点，一个STAT6结合位点。
　　4.突变体荧光素酶报告基因实验发现CAAT元件和STAT3位点发生点突变后，荧光素酶活性显著下降。而STAT6位点突变后，荧光素酶活性无明显变化。
　　5.EMSA蛋白-DNA结合实验发现，[32p]-STAT3-wt探针和MG-63细胞核蛋白提取物孵育后能被检测到DNA-蛋白复合物的形成。作为阳性对照的[32p]-STAT3-consensus同样被检测到形成DNA-蛋白复合物并且迁移到同一个位置。其次，[32p]-STAT3-wt探针一蛋白复合物的形成能明显被STAT3-consensus、未标记探针和STAT3抗体竞争抑制，而不会被碱基序列突变的探针竞争抑制。
　　结论:STAT3蛋白能结合到miR-125b前体序列的核心启动区转录激活miR-125b。
　　第四节骨肉瘤细胞miR-125b启动子区域甲基化状态
　　目的:探讨骨肉瘤细胞中miR-125b启动子区域的DNA甲基化状态。
　　方法:选用骨肉瘤细胞系MG-63和Saos-2，使用去甲基化药物5-Aza-2'-deoxycytidine处理细胞后，观察其对细胞增殖和细胞内miR-125b表达水平的影响。同时通过试剂盒提取MG-63和Saos-2中的DNA，再经过亚硫酸氢钠的处理，最后通过甲基化特异性PCR检测miR-125b启动子区域的DNA甲基化状态。
　　结果:
　　1.随着去甲基化药物5-Aza-2'-deoxycytidine浓度的提高，细胞的增殖受到明显的抑制作用。
　　2.随着去甲基化药物5-Aza-2'-deoxycytidine浓度的提高，miR-125b表达水平明显升高。
　　3.甲基化特异性PCR检测骨肉瘤细胞miR-125b启动子区域的甲基化水平升高。
　　结论:骨肉瘤细胞中miR-125b表达水平的降低可能与miR-125b启动子区域DNA的高甲基化相关。
　　第二部分血清microRNA作为骨肉瘤生物标记物的研究
　　目的:筛选出骨肉瘤病人血清标本中差异表达的microRNA，研究其作为诊断骨肉瘤血清标记物的潜能。
　　方法:采用microRNA PCR芯片筛选骨肉瘤患者和正常对照组血清microRNA表达谱，选择差异表达的血清microRNA。将筛选出来的候选microRNA进一步用qRT-PCR在20例肿瘤标本和20例正常对照组验证，ROC分析用来评价其诊断性能。
　　结果:首先通过芯片筛选出来14个候选microRNA，在此基础上，扩大标本量验证，得7个差异表达的血清microRNA(miR-106a-5p,miR16-5p, miR-20a-5p, miR-425-5p, miR451a, miR-25-3P,miR139-5p), AUC分别是0.7255(95％ CI0.5435-0.9075),0.7686(95％CI0.6067-0.9306),0.8471(95％ CI0.7155-0.9786),0.7961(95％ CI0.6438-0.9484),0.7765(95％ CI0.6163-0.9366),0.7961(95％0.6420-0.9501)和0.7098(95％0.5308-0.8888)。
　　结论:骨肉瘤中的血清microRNA存在差异表达谱，且有潜力成为骨肉瘤诊断和预测分子标记物。

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