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microRNA-195对心肌成纤维细胞增殖及向成肌纤维细胞分化的调控作用

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摘要

缩略词表

前言

材料与方法

一、材料

二、方法与步骤

结果

1．心肌成纤维细胞向成肌纤维细胞分化

2．MicroRNA对心肌成纤维细胞增殖的调节作用

3．MiR-195抑制心肌成纤维细胞增殖及分化

4．MiR-195通过调节Chek1抑制心肌成纤维细胞增殖及分化

讨论

结论

参考文献

综述

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摘要

目的：观察miR-195在心肌纤维化（cardiac fibrosis）中的预防性治疗作用，并进一步研究miR-195是否通过Chek1激活心肌成纤维细胞(CF)的增殖及向成肌纤维细胞(CMF)的分化，以探讨miR-195在心肌纤维化中的作用机制。
　　方法：⑴提取心肌成纤维细胞:1.取1-3天新生SD大鼠心脏置于胰胶原酶溶液中反复消化，收集细胞差速贴壁3小时后获得相对较纯的心肌成纤维细胞，此为P0代，第二天将P0代1∶3传代，此为P1代，以后每4天传代;2.应用Real-timePCR、蛋白质印迹法、免疫荧光检测成肌纤维细胞特异表达蛋白α-SMA的表达量标记分化。⑵MiR-195在心肌成纤维细胞增殖及分化中的作用机制:1.采用Real-time PCR检测miR-195在P1、P2、P3代细胞中的表达量;2.MiR-195的激动剂agomir或抑制剂antagomir转染P1代细胞，48小时后用Real-time PCR检测miR-195的表达评价转染效率，Real-time PCR、蛋白质印迹法、免疫荧光检测α-SMA的表达量，免疫荧光检测EDU、Ki67的阳性率、蛋白质印迹法检测PCNA标记细胞增殖，Real-time PCR检测细胞周期基因Chek1、Cdc2a、Birc5、Nusap1、Spag5的表达量，蛋白质印迹法检测Chek1的表达量。⑶Chek1对心肌成纤维细胞增殖及分化的调控作用:用Chek1的干扰RNA-siRChek1转染P1代细胞，72小时后Real-time PCR检测Chek1的表达量以评价干扰效率，Real-time PCR、免疫荧光检测α-SMA的表达量，免疫荧光检测EDU的阳性率。（四）计数资料采用均数±标准差(x±s)表示，各组间样本均数的比较采用单因素方差分析， p＜0.05认为有统计学意义。全部数据采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理，用GraphPad Prism5做图。
　　结果：①新生SD大鼠心肌成纤维细胞向成肌纤维细胞分化:成肌纤维细胞的特异性表达蛋白α-SMA在P2、P3代的表达量均高于P1代（p值均＜0.05）。②miR-195抑制心肌成纤维细胞增殖及分化:1.MiR-195的表达量随细胞传代次数增加而升高，在P3代的表达量显著升高（p值均＜0.05）;2.激动剂转染细胞后miR-195的表达量升高（p值均＜0.05），抑制剂转染细胞后miR-195的表达下降（p值均＜0.05）;3.高表达miR-195后EDU、Ki67的阳性率及PCNA、α-SMA的表达量降低，降低miR-195后EDU、Ki67的阳性率及PCNA、α-SMA的表达量升高，差异均有统计学意义(p＜0.05);4.MiR-195负向调节细胞周期基因Chek1，差异有统计学意义(p＜0.05)。③MiR-195通过Chek1调控心肌成纤维细胞的增殖及分化:1.SiRChek1转染细胞后Chek1的表达量明显低于对照组（p值均＜0.05）。2.EDU的阳性率、α-SMA的表达量在siRChek1组、miR-195 antagomir与siRChek1共转染组均明显低于对照组（p值均＜0.05），而siRChek1组与共转染组间无统计学差异。
　　结论：MiR-195表达量的上调可能是抑制心肌成纤维细胞增殖以及向成肌纤维细胞分化的分子机制之一，该效应主要是通过负向调节细胞周期基因Chek1实现的。

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