解纤维热酸菌L-阿拉伯糖异构酶的克隆表达、性质研究及分子改造

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第一章 绪论

1.1 概述——功能性甜味剂

1.2 稀有糖

1.2.1 稀有糖的定义

1.2.2 稀有糖的研究进展

1.3 D-塔格糖

1.3.1 D-塔格糖的结构和理化性质

1.3.2 D-塔格糖的代谢途径

1.3.3 D-塔格糖的生理功能

1.3.4 D-塔格糖的生物法制备

1.4 L-阿拉伯糖异构酶的研究进展

1.4.1 L-阿拉伯糖异构酶的微生物来源

1.4.2 L-阿拉伯糖异构酶的性质

1.4.3 L-阿拉伯糖异构酶的蛋白质基因工程

1.4.4 L-阿拉伯糖异构酶与D-塔格糖的生产

1.5 本课题的立题依据和意义

1.6 本课题研究思路与主要内容

参考文献

第二章 A.cellulolytics L-阿拉伯糖异构酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌种与质粒

2.2.2 培养基

2.2.3 主要试剂

2.2.4 主要仪器

2.2.5 L-5可拉伯糖异构酶基因的克隆

2.2.6 L-阿拉伯糖异构酶基因在大肠杆菌中的表达

2.3 结果与讨论

2.3.1 L-阿拉伯糖异构酶基因的扩增

2.3.2 PCR产物的克隆

2.3.3 L-阿拉伯糖异构酶基因的测序及序列分析

2.3.4 L-阿拉伯糖异构酶表达质粒的构建

2.3.5 表达产物的SDS-PAGE分析

2.3.6 诱导表达条件的优化

2.3.7 重组细胞催化D-半乳糖异构化反应

2.4 本章小结

参考文献

第三章 重组L-阿拉伯糖异构酶的分离、纯化及活性研究

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌种及保藏方法

3.2.2 主要实验材料

3.2.3 主要实验仪器

3.2.4 主要实验方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 Q-Sepharose Fast Folw离子交换层析

3.3.2 Superdex 200(10/300 GL)凝胶过滤层析

3.3.3 Superdex 200凝胶色谱确定L-阿拉伯糖异构酶分子量

3.3.4 纯化结果及SDS-PAGE电泳鉴定

3.4 本章小结

参考文献

第四章 L-阿拉伯糖异构酶的酶学性质研究

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 主要实验仪器

4.2.3 主要实验方法

4.3 结果与讨论

4.3.1 最适温度及最适pH

4.3.2 金属离子对酶活的影响

4.3.3 热稳定性及pH稳定性

4.3.4 L-5可拉伯糖异构酶的底物特异性研究

4.3.5 L-阿拉伯糖异构酶的反应动力学常数

4.4 本章小结

参考文献

第五章 A.cellulolytics L-阿拉伯糖异构酶的催化机理初探及分子改造

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌种与质粒

5.2.2 主要试剂

5.2.3 主要仪器

5.2.4 主要实验方法

5.3 结果与讨论

5.3.1 L-阿拉伯糖异构酶的结构分析及活性位点预测

5.3.2 改造位点的确定

5.3.3 L-阿拉伯糖异构酶基因定点突变PCR扩增

5.3.4 L-阿拉伯糖异构酶突变体基因的测序及序列分析

5.3.5 L-阿拉伯糖异构酶突变体表达质粒的构建

5.3.6 表达产物的SDS-PAGE分析

5.3.7 突变体酶纯化结果SDS-PAGE电泳鉴定

5.3.8 突变体酶催化性质研究

5.4 本章小结

参考文献

论文主要结论

论文创新点

致谢

附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文