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人脐带间质干细胞外泌体对肾间质纤维化的修复及机制研究

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第一章 绪 论

1.1肾间质纤维化

1.2脐带间质干细胞在损伤修复中的应用

1.3间质干细胞来源的exosome及其在损伤修复中的应用

1.4 exosome作为基因及药物载体的应用

1.5 科学问题的提出

第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义

2.1 研究目的

2.2 研究方法

2.3 实验设计方案

2.4 研究意义

第三章 HucMSC-exosome对UUO模型的修复及机制研究

3.1 实验材料与仪器

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 HucMSC-exosome抑制TGF-β1诱导的NRK-52E细胞的上皮间质转化

4.1 实验材料与仪器

4.2 方法

4.3 结果

4.4 讨论

结论及展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文与参加的会议

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摘要

目的:
　　课题组前期研究已发现人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchy stem cell,hucMSC)及其分泌的外泌体（hucMSC-exosome）能缓解由顺铂诱导的急慢性肾损伤，microRNA（miRNA）在其中发挥重要作用。在此基础上，本课题建立了大鼠单侧输尿管结扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）肾间质纤维化模型和转化生长因子β1(TGF-β1)细胞诱导模型，通过体内外实验评价hucMSC-exosome缓解肾间质纤维化中的作用，并初步探讨其中的作用机制。
　　方法:
　　体内实验分3组，假手术组：SD大鼠经左侧腹部切口打开腹腔寻到输尿管后缝合；UUO组：SD大鼠开腹进行单侧输尿管结扎；hucMSC-exosome干预组：SD大鼠单侧输尿管结扎24h后，经尾静脉注射hucMSC-exosome。小动物活体成像观察hucMSC-exosome在大鼠模型体内的分布。术后不同时间点（12h,24h,48h,72h,7d,14d）采集大鼠血清，检测血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）水平；单侧输尿管结扎14d后处死大鼠，获取肾组织，HE染色观察不同组别的肾脏组织结构，Masson染色分析胶原沉积情况；免疫组织化学、免疫荧光、Western blot检测肾组织中上皮间质转化（epithelia-mesenchymal transition, EMT）相关分子，上皮钙黏着蛋白（E-cadherin，E-cad）、神经钙黏着蛋白（N-cadherin，N-cad）、赖氨酸氧化酶相关蛋白2（LOXL2）及纤维化相关蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、TGF-β1、α1-I型胶原（COL1A1）的表达水平。
　　体外实验：
　　大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）种植于6孔板上，细胞不做任何处理的为对照组。诱导组采用40ng剂量的TGF-β1诱导NRK-52E细胞24h使细胞发生EMT改变，干预组在 TGF-β1诱导后加入hucMSC-exosome共培养48h。倒置显微镜观察各组别的细胞形态和细胞密度。Western blot检测各组细胞中E-cadherin、N-cadherin、LOXL2及α-SMA、TGF-β1、COL1A1的表达， qRT-PCR检测各组NRK-52E细胞miRNA（miR-199a、miR-146b）的表达。
　　结果:
　　小动物活体成像结果显示经尾静脉注射的荧光标记hucMSC-exosome大部分到达损伤左肾，右肾、脾脏、肺中略有存在，假手术组各脏器均没有荧光表达，显示hucMSC-exosome具有向损伤部位趋化的能力；hucMSC-exosome干预组中血清肌酐尿素氮较UUO组显著下降，提示肾脏功能有所恢复；HE染色结果表明hucMSC-exosome干预组较UUO组,肾小管扩张减缓，炎性细胞浸润减少，肾小管结构完整；Masson染色结果显示，hucMSC-exosome干预组肾间质中胶原沉积减少；与UUO组相比， hucMSC-exosome干预组E-cadherin表达增加，N-cadherin减少，提示间质上皮转化，α-SMA、TGF-β1、COL1A1等纤维化相关蛋白表达下降，表明hucMSC-exosome干预后肾间质纤维化改善。免疫荧光、免疫组化和Western blot检测EMT进程中关键蛋白LOXL2，发现UUO组LOXL2表达上调，而hucMSC-exosome干预后LOXL2表达下降。
　　TGF-β1诱导NRK-52E细胞形态出现显著变化，由原来的光滑卵圆形变为不规则长梭形，细胞密度明显下降，E-cadherin表达下降，N-cadherin增加。HucMSC-exosome干预后，Western blot检测显示E-cadherin表达增加，N-cadherin、α-SMA、COL1A1、TGF-β1下调，EMT进程得到缓解。qRT-PCR检测三组细胞miR-199a表达发现，TGF-β1诱导后miR-199a表达低于对照组，而hucMSC-exosome干预后miR-199a较诱导组含量明显增加，分析后具有统计学意义。
　　结论:
　　hucMSC-exosome在体内外均可逆转纤维化并缓解EMT，其作用机制与LOXL2蛋白和hucMSC-exosome中包裹的miRNAs有关。

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