猪博卡病毒在我国部分地区的分子流行病学调查及其荧光定量PCR方法的建立与应用

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细小病毒科中博卡病毒属成员具有特征性的第三个开放阅读框(Open ReadingFrame，ORF)，其中猪博卡病毒(Porcine bocaviruses，PBoVs)表现出最强的遗传多样性。基于衣壳蛋白(Capsid protein，VP1)核苷酸及氨基酸序列进行分类，将已经报道的15株近全长序列分为了9个种:PoBoV1包含porcine boca-like virus(PBo-likeV)和PBoV1-H8,PoBoV2包含porcine parvovirus4-c14(PPV4-c14)和PPV4-c17,PoBoV3包含PBoV1、PBoV2和PBoV2-A6，PoBoV4-8分别包含6V，PBoV3-NI，PBoV4-NI，PBoV3-HK和PBoV4-1-HK、PBoV4-2-HK，PoBoV9包含7V和PBoV5。其中PoBoV3及PoBoV9各有2个基因型。对收集自中国2010年10省市的166份病料进行PBo-likeV、PPV4、PBoV1、PBoV2、6V、7V、PBoV3-NI及PBoV4-NI检测显示，其阳性率分别为28.9％、6.6％、9.0％、12.7％、22.3％、31.3％、15.1％和14.5％。PBoVs之间及其与其他常见病毒如猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)和猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)共感染非常普遍。
　　通过PCR方法扩增了PoBoV1的NP1基因，将其连接到表达载体pET32(P3)中，构建了重组质粒NP1-pET32(P3)。转化后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达，获得大小约55KD以可溶形式存在于菌体中的NP1重组蛋白。蛋白经镍柱纯化后免疫实验兔，获得抗血清。制备的血清通过ELISA发现抗体效价达到1∶64000，Western-blot鉴定显示多抗能与NP1蛋白发生特异性免疫反应。
　　根据当时GenBank中公布的唯一PoBoV1基因组序列（登录号:FJ872544），针对其结构蛋白VP1基因的保守序列，设计合成特异性扩增引物及Taqman探针。以本实验室构建的pPBoVZJ0901克隆质粒为标准品，通过对退火温度、反应总体系、探针浓度以及模板浓度进行调整，建立了PoBoV1的Taqman荧光定量PCR方法。优化反应条件后，特异性检测试验发现，用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪源牛病毒性腹泻病毒及其他基因型猪博卡病毒等结果均呈阴性，而检测PoBoV1阳性病料呈阳性。敏感性检测试验表明该方法在4.89×100copies/μl～4.89×109copies/μl范围内线性关系良好，最低检测限为4.89×100copies/μl。重复性试验结果显示组内及组间变异系数均低于3％。用建立的荧光定量PCR方法检测实验猪不同时期所采集的血清及处死后收集的各组织样品中PoBoV1的病毒含量，结果发现，血清中病毒含量较低，约4.89×101copies/μl，而不同组织病毒含量差异较大，最高的为肾脏，达到1.83×104copies/μl。

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作者
张宏彪;
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作者单位

南京农业大学;

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授予单位南京农业大学;
学科预防兽医学
授予学位硕士
导师姓名刘永杰,袁世山;
年度 2012
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 S852.659.2;S854.43;
关键词
猪博卡病毒; 病毒分类; 流行病学调查; 多克隆抗体; 组织嗜性; 荧光定量PCR;

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