以β-catenin为关键信号转导分子的Wnt信号转导通路在雌性发育过程中有重要作用,其表达缺失或者突变都会引起Wnt/β-catenin信号转导紊乱,从而对机体组织或细胞产生重要影响。敲除Wnt4可导致小鼠在出生前部分的性反转以及卵母细胞的衰竭,在敲除β-catenin的小鼠颗粒细胞中形成内含紊乱和多形性粒层细胞的卵泡样结构,可导致颗粒细胞癌的发生。近来发现,β-catenin参与了促性腺激素释放激素调控的转录网络,对激素生成有重要作用。 本研究以二花脸、皮特兰,商品杂种猪的卵巢以及猪卵巢颗粒细胞为实验材料,利用real time RT-PCR检测了不同猪种卵巢内β-catenin以及不同生长时期卵泡与卵巢颗粒细胞、卵母细胞内β-catenin的表达水平；利用RNAi方法敲减β-catenin,同时利用LiCl拮抗GSK-3β对β-catenin的磷酸化、降解作用,使胞质内β-catenin含量积聚的原理,用LiCl持续处理颗粒细胞使之过表达。利用流式细胞术、real time RT-PCR、western blot等方法从沉默和过表达两个方面研究β-catenin基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡以及类固醇激素合成酶的影响。 主要研究结果如下: 1利用real time RT-PCR法检测不同品种猪卵巢以及不同生长时期猪卵泡及卵巢颗粒细胞、卵母细胞内Wnt/β-catenin信号通路关键信号转导分子β-catenin的表达情况,结果表明:β-catenin在不同品种猪卵巢中有差异表达,二花脸猪卵巢内的β-catenin表达量是普通商品猪卵巢的近3倍(p<0.05),而皮特兰猪巢内的β-catenin表达量只有普通商品猪卵巢的40％。β-catenin在卵泡的不同发育阶段有差异表达,大卵泡中β-catenin表达量显著高于中卵泡和小卵泡(p<0.05)。β-catenin在卵巢颗粒细胞和卵母细胞中亦有差异表达,颗粒细胞中β-catenin含量是卵母细胞中的近2.5倍(p<0.05)。 2为了研究Wnt/β-catenin信号通路在猪卵泡颗粒细胞中的作用,本研究从猪卵巢卵泡(3-5mm)内分离颗粒细胞(pGCs)进行体外培养。基于β-catenin在该通路中的核心地位,分别采用RNAi技术“沉默”猪β-catenin基因,阻抑Wnt/β-catenin信号通路,LiCl处理激活Wnt/β-catenin信号通路以检测β-catenin对猪卵泡颗粒细胞凋亡和类固醇激素合成的影响。结果表明:(1)采用的RNAi技术成功地“敲减”猪β-catenin基因,在mRNA水平该基因被下调59.93％(p<0.05),蛋白水平被下调。建立了Wnt/β-catenin信号通路阻抑的细胞模型。敲减β-catenin显著增加细胞凋亡率,上调Bax的表达(32.76％,p<0.05),下调BCL-2的表达(44.28％,p<0.05),并下调P450arommRNA的表达(47.72％,p<0.05),但不影响P450scc的表达。(2)LiCl处理成功激活Wnt/β-catenin通路,β-catenin在mRNA水平该基因被上调95.15％(p<0.05),蛋白水平被上调。建立了Wnt/β-catenin信号通路激活的细胞模型。过表达β-catenin显著增加细胞凋亡率下调Bax的表达(25.60％,p<0.05),上调BCL-2的表达(12.58％,p>0.05),并上调P450arom mRNA(151.6％,P<0.05)和P450scc mRNA(124.3％,p<0.05)的表达。表明Wnt/β-catenin信号通路在猪卵泡颗粒细胞中有重要的调控作用。
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