鼠抗人PD-1单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

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共刺激分子PD-1属于B7家族成员，是大小为50-55kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白。PD-1分子诱导性表达于活化的T细胞、B细胞、N K细胞、N KT细胞、单核细胞和树突状细胞。PD-1与其配体PD-L1或PD-L2相互作用后发挥免疫抑制作用，在机体免疫耐受维持、免疫应答调节中发挥重要作用。PD-1/PD-L1途径在自身免疫性疾病、慢性感染、肿瘤等疾病的病理过程中具有重要作用。多种肿瘤患者体内PD-1及 PD-L1分子异常表达，可作为肿瘤诊断和预后的辅助指标，阻断PD-1/PD-L1途径已成为肿瘤免疫治疗的新手段。
　　本文构建了稳定表达人 PD-1分子的基因工程细胞株 L929/PD-1，并以L929/PD-1细胞作为免疫原，采用B淋巴细胞杂交瘤技术，获得1株持续稳定表达抗人PD-1的单抗，并对该单抗的生物学特性进行了初步研究。
　　一、人PD-1基因工程细胞株的构建
　　目的：构建稳定表达人PD-1分子的基因工程细胞株。
　　方法：将逆转录病毒载体pEGZ-Term-R与编码人PD-1分子的全长cDNA经双酶切、T4连接后，获重组逆转录病毒表达载体pEGZ-Term-R/PD-1。采用脂质体转染法将pEGZ-Term-R/PD-1表达载体和辅助病毒载体共转染293T细胞，收集含完整重组逆转录病毒、具感染力的细胞培养上清，感染L929细胞。经G418抗生素筛选、流式细胞术多次检测，获得稳定表达人 PD-1分子的基因工程细胞株。
　　结果：获得一株稳定表达人 PD-1分子的基因工程细胞株L929/PD-1，此基因工程细胞株可高表达人PD-1分子，且长期反复传代后仍稳定高表达。
　　结论：成功构建稳定表达人PD-1分子的基因工程细胞株L929/PD-1，为后续实验提供了免疫原，同时也可为进一步研究PD-1/PD-L1途径在多种疾病中的作用机制提供研究工具。
　　二、鼠抗人PD-1单克隆抗体的研制及其生物学特性鉴定
　　目的：制备鼠抗人PD-1单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。
　　方法：以稳定表达人PD-1分子的基因工程细胞株L929/PD-1免疫BALB/c小鼠，采用流式细胞术筛选分泌鼠抗人PD-1单抗的杂交瘤细胞株。用IgG亚型快速定性试纸法、肿瘤细胞株及人PBMCs表面PD-1分子识别谱检测、抗体效价测定、竞争结合实验、Western Blot及ELISA等方法对所获PD-1单抗的生物学特性进行分析鉴定。
　　结果：获得1株持续稳定分泌PD-1单抗的杂交瘤细胞株，命名为6E1。单抗6E1的重链为IgG1、轻链为κ。单抗6E1对肿瘤细胞株U937、Thp-1、Jurkat细胞及人PBMCs表面PD-1分子的识别谱与商品化PD-1单抗MIH4一致。单抗6E1与商品化抗体MIH4具有相似的识别位点。Western Blot法及ELISA法的检测结果均表明单抗6E1可特异性识别PD-1分子。
　　结论：成功获得1株鼠抗人PD-1单克隆抗体，可用于免疫荧光染色、流式细胞术分析、Western Blot分析、ELISA分析等多种实验分析，为研究PD-1/PD-L1途径提供有力的工具。

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作者
曹莎莎;
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作者单位

苏州大学;

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授予单位苏州大学;
学科免疫学
授予学位硕士
导师姓名居颂光;
年度 2016
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类医学免疫学;
关键词
共刺激分子PD-1; 单克隆抗体; 生物学特性; 抗体制备;

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