淋病奈瑟菌粘附因子受体hCEACAM1转基因小鼠模型的建立及初步应用

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淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)是导致人类淋病(gonorrhea)的病原菌。人是淋病奈瑟菌的唯一宿主，经性行为传播，多侵袭泌尿生殖道黏膜，主要引起男性的急性尿道炎、前列腺炎、附睾炎等；在女性主要以隐形感染为主，常因不能及时医治而最终导致盆腔炎、子宫内膜炎、输卵管炎、甚至导致不孕症。淋病在全球范围内流行广泛，是发病率最高的性传播疾病(STD)之一。近年来随着淋病奈瑟菌耐药性的日益增强，淋病的治疗变得越发困难，深入研究淋病奈瑟菌的生物学特性及其与宿主间的相互作用机制，研制有效的淋病疫苗和治疗药物成为淋病防治工作的重中之重。但是缺乏有效的动物模型却阻碍着淋病的研究进程。研究证实，黏附定植于黏膜组织是淋病奈瑟菌感染的第一步，也是关键性的一步。淋病奈瑟菌的黏附定植是一个非常复杂的过程，涉及淋病奈瑟菌多种黏附因子和机体细胞上相应受体间的相互作用，其中Opa蛋白与其受体间的结合使得淋病奈瑟菌最终得以实现感染。Opa蛋白是淋病奈瑟菌编码的一组易变异的外膜蛋白，共有11～12种：OpaA、B、C......K(L)。绝大多数种类的Opa蛋白可以人癌胚抗原相关细胞黏附分子1(human carcinoembryonic antigen related cellularadhesion molecule1，hCEACAM1)为受体，95％以上的淋病奈瑟菌临床分离株均可与hCEACAM1结合。Opa蛋白与hCEACAM1的结合使得淋病奈瑟菌的黏附作用更加紧密，淋病奈瑟菌进而穿过上皮细胞，进入黏膜下层产生炎症。直接表达于泌尿生殖道黏膜上皮细胞顶面的hCEACAM1提供了淋病奈瑟菌感染的穿入点或侵入组织的一扇门，在淋病奈瑟菌的感染过程中具有重要意义。细胞模型研究证明，表达hCEACAM1的动物细胞均可以接受淋病奈瑟菌的粘附和侵入，提示hCEACAM1转基因小鼠可成为淋病研究的良好动物模型。本课题利用前期构建的hCEACAM1真核表达载体，通过显微注射法制备了hCEACAM1转基因小鼠，并初步研究了其在淋病奈瑟菌感染动物模型中的应用价值。研究主要分为以下几个部分：一、显微注射法制备hCEACAM1转基因小鼠在本实验室前期工作的基础上，将表达hCEACAM1的基因构件通过显微注射的方法注射到C57BL/6品系小鼠的受精卵中，得到hCEACAM1转基因F0代小鼠共22只。通过PCR技术反复筛选并将PCR产物测序分析，得到4只(50＃、53＃、54＃、59＃)PCR阳性的hCEACAM1 F0代转基因小鼠。初筛后的4只PCR阳性小鼠分别与同品系正常小鼠交配繁殖，得到的F1代小鼠通过PCR方法反复筛选，对阳性小鼠进行同组间的兄妹交配，得到F2、F3代转基因小鼠。F2、F3代转基因小鼠同样通过PCR的方法进行反复筛选，得到的阳性小鼠继续采用同组的兄妹交配方法进行繁殖，以期能得到纯合子的hCEACAM1转基因小鼠。二、hCEACAM1多克隆抗体的制备为了进一步分析hCEACAM1蛋白在转基因小鼠体内的表达情况，通过分析，找出hCEACAM1蛋白胞外区中抗原特异性最强的一段表位，采用PCR方法扩增出其编码序列，并将其连进pGEX-4T-1载体中，进行原核表达。以表达的GST-hCEACAM1融合蛋白为抗原，应用切胶免疫的方法制备了抗hCEACAM1的多抗血清。通过与商品化的hCEACAM1单抗比较，证实了所制备的抗hCEACAM1多抗血清能特异性识别hCEACAM1蛋白。三、hCEACAM1转基因小鼠体内目的基因的表达应用制备的hCEACAM1多抗血清对4只F0代PCR阳性转基因小鼠进行了体内hCEACAM1蛋白表达情况的分析。通过Western-blot方法证实，在4只F0代PCR阳性小鼠中，只有53＃F0代小鼠及其后代体内各组织器官表达了hCEACAM1蛋白，同时应用免疫荧光的方法证实了hCEACAM1蛋白定位表达于细胞膜上。由此鉴定，我们成功获得了hCEACAM1转基因小鼠。四、hCEACAM1转基因小鼠的淋病奈瑟菌感染实验为研究hCEACAM1转基因小鼠在淋病研究中的应用价值，我们在转基因小鼠数量较少的情况下，选择了4只hCEACAM1阳性小鼠，进行了淋病奈瑟菌体内感染实验。实验结果表明，相对于对照组的正常小鼠，淋病奈瑟菌在hCEACAM1转基因小鼠中的存活时间显著延长，但是没有引起小鼠产生炎症反应。由于实验小鼠的数量严重不足，这只是对淋病奈瑟菌体内感染实验的一个初步探索，不具有统计学意义，但其结果预示着其作为研究淋病动物模型的可能性。

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作者
王小红;
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作者单位

扬州大学;

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授予单位扬州大学;
学科动物学
授予学位硕士
导师姓名李国才;
年度 2009
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类淋病;
关键词
淋病奈瑟菌; 粘附因子; hCEACAM1; Opa蛋白; 动物模型;

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