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LncRNA-AV310809通过调控Wnt2/βcatenin信号通路促进TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞上皮间质转分化过程

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中英文缩略词表

第1章 引言

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞来源

2.1.2 试剂及耗材胎牛血清(FBS)

2.1.3 主要试剂的配制

2.1.4 主要仪器及耗材

2.2实验方法

2.2.1 细胞培养与传代

2.2.2 细胞冻存与复苏

2.2.3 细胞计数

2.2.4 质粒转染

2.2.5 RT-PCR检测各组RNA的表达

2.2.6 western blot检测各组蛋白表达水平

2.2.7 细胞免疫荧光

2.2.8 MTT法检测细胞增殖

2.2.9 细胞划痕实验

2.2.10 统计学分析

第3章 结果

3.1 TGF-β1诱导HMrSV5细胞EMT发生

3.2 TGF-β1刺激HMrSV5细胞后,lncRNA-AV310809表达上调

3.3 TGF-β1刺激 HMrSV5细胞后,Wnt2/β-catenin信号通路被活化

3.4 质粒转染效果鉴定

3.5 过表达 lncRNA-AV310809 促进 TGF-β1 诱导的 HMrSV5 细胞EMT发生

3.5.1 过表达lncRNA-AV310809对HMrSV5细胞形态的影响

3.5.2 过表达lncRNA-AV310809对HMrSV5细胞EMT相关蛋白表达水平的影响

3.6 过表达lncRNA-AV310809促进TGF-β1诱导的Wnt2/β-catenin信号通路的活化

3.7 过表达lncRNA-AV310809对HMrSV5细胞增殖和迁移修复能力的影响

第4章 讨论

第5章 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间的研究成果

综述:长链非编码RNA在纤维化疾病中的研究进展

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摘要

目的:
  通过前期lncRNA基因芯片筛选,我们寻找到了与腹膜纤维化相关的关键性长链非编码 RNA(lncRNA-AV310809),共表达网络分析预测其可能通过纤维化信号通路(Wnt2/β-catenin信号通路)发挥作用。本研究旨在进一步通过体外实验探讨该关键性lncRNA在腹膜纤维化过程中的作用及具体调控机制。
  方法:
  1、体外培养腹膜间皮细胞系(HMrSV5),运用浓度为7ng/ml的转化生长因子(TGF-β1)刺激细胞48h,建立腹膜间皮细胞间质转分化(EMT)模型。运用Western blot检测纤维连接蛋白(FN)、I型胶原蛋白(COL-I)、E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;运用实时定量PCR验证 lncRNA-AV310809表达水平的改变;通过 Western blot观察 TGF-β1对Wnt2/β-catenin信号通路的影响。2、运用TGF-β1刺激已转染lncRNA-AV310809过表达质粒或阴性对照质粒的HMrSV5细胞。用光镜观察HMrSV5细胞形态的变化;Western blot及免疫荧光检测FN、COL-I、E-cadherin、α-SMA蛋白表达变化以及对Wnt2/β-catenin信号通路的影响。3、运用MTT及划痕损伤实验观察lncRNA-AV310809对HMrSV5细胞增殖及迁移的影响。
  结果:
  1、TGF-β1可诱导HMrSV5细胞EMT发生,即上皮表型E-cadherin蛋白表达水平降低,而间质表型FN、COL-I及α-SMA蛋白表达水平升高;2、TGF-β1在诱导HMrSV5细胞发生EMT的同时上调了lncRNA-AV310809的表达水平(差异倍数1.30倍,P=0.02);3、TGF-β1在诱导HMrSV5细胞发生EMT的过程中Wnt2/β-catenin信号通路被活化(Wnt2、β-catenin蛋白表达增加);4、过表达lncRNA-AV310809可能通过 Wnt2/β-catenin信号通路作用于 TGF-β1诱导的HMrSV5细胞 EMT发生:○1过表达 lncRNA-AV310809促进了 TGF-β1诱导的HMrSV5细胞梭形样形态改变;○2过表达lncRNA-AV310809促进了TGF-β1诱导的HMrSV5细胞E-cadherin蛋白表达减少,而FN、COL-I及α-SMA蛋白表达增加;○3过表达lncRNA-AV310809促进了TGF-β1诱导的HMrSV5细胞Wnt2、β-catenin蛋白表达增加;5、lncRNA-AV310809可能抑制了HMrSV5细胞增殖及迁移修复能力。
  结论:
  LncRNA-AV310809在TGF-β1诱导的HMrSV5细胞EMT过程中表达上调;LncRNA-AV310809可能通过激活Wnt2/β-catenin信号通路促进TGF-β1诱导的HMrSV5细胞EMT发生而参与腹膜纤维化过程。

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